【摘 要】
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目的:本文旨在通过GSTPull-down、免疫荧光、酵母双杂交等技术初步研究自噬受体Optineurin在参与细胞凋亡调控、NF-KB信号通路,抗病毒和细菌感染的作用机制。为进一步研究OPT
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目的:本文旨在通过GSTPull-down、免疫荧光、酵母双杂交等技术初步研究自噬受体Optineurin在参与细胞凋亡调控、NF-KB信号通路,抗病毒和细菌感染的作用机制。为进一步研究OPTN在青光眼、神经退行性疾病中的作用机制奠定了研究基础。 方法:分别构建以下克隆:pET28a-OPTN-HA、pGEX-4T-1-LC3、重组载体pCDGFP-OPTN真核表达载体,将酶切鉴定正确的重组质粒送公司测序;利用大肠杆菌BL21菌株表达并体外纯化GST-LC3融合蛋白和OPTN蛋白,通过GSTPull-down技术检测OPTN蛋白与LC3蛋白在体外相互作用的情况;利用免疫荧光技术观察OPTN蛋白在细胞内的定位情况,以OPTN一抗结合细胞内源的OPTN后以Cy5(goat-anti-mouse,红光)偶联的二抗荧光显示内源OPTN的分布定位;构建重组载体pRFP-C-RS-shOPTN,经鉴定正确后转染HEK293FT细胞,荧光显微镜下观察shRNA转染情况,蛋白质印迹法检测OPTN蛋白表达检测其干扰效率;沙门氏菌感染实验检测沙门氏菌在细胞内的增殖,进一步检测OPTN蛋白干扰后对OPTN蛋白作为自噬受体功能的影响;还构建了pGBKT7-OPTN酵母表达载体,利用酵母双杂交技术筛选E3库。 结果:酶切鉴定和测序结果都证明了各种质粒构建成功。GSTPull-down实验表明,在体外条件下,OPTN蛋白与LC3蛋白存在相互作用。免疫荧光实验表明,在HEK293FT细胞中,OPTN蛋白主要分布在细胞质中。酵母双杂交也筛选出了相应的E3ligase。 结论:通过GSTPull-down、免疫荧光、酵母双杂交等实验证明参与细胞凋亡调控,、NF-KB信号通路,抗病毒和细菌感染的作用机制。为进一步研究OPTN在青光眼、神经退行性疾病中的作用机制奠定了研究基础。
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