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正畸治疗可以通过移动牙齿改善患者的外貌和笑容,在我国越来越多的成人患者开始寻求完善的正畸治疗,但牙周病高发病率是成人正畸中无法忽视的问题。牙周病发病的主要临床表现是慢性炎症导致的牙周组织丧失、牙齿松动脱落,目前对牙周病的治疗主要包括炎症控制和牙周组织再生等方法。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）因其高增殖分化能力和组织同源性被看作牙周再生中最重要的种子细胞之一。正畸牙齿移动时,PDLSCs可以对力学刺激产生应答,在牙周组织改建中发挥了重要的调控作用。研究表明,牙周炎微环境下PDLSCs的再生能力会受到损害,但其对力的反应是否出现异常尚未可知。Lnc RNA已被证实在炎症性疾病的发生发展中具有重要的调控作用,同时已有研究显示健康牙周组织和牙周病牙周组织中存在大量差异表达的Lnc RNA,但Lnc RNA是否调控健康牙周组织来源的PDLSCs（PDLSCs obtained from healthy periodontal tissues,HPDLSCs）和牙周病组织来源的PDLSCs（PDLSCs obtained from periodontal tissues of periodontitis patients,PPDLSCs）对静态牵张力（Static mechanical strain,SMS）的反应还有待研究。因此针对上述问题,本课题进行了两部分研究:第一部分HPDLSCs和PPDLSCs对不同级别SMS的反应及最佳力值筛选研究目的1.分离培养HPDLSCs和PPDLSCs并鉴定其生物学特性2.明确不同级别SMS对HPDLSCs和PPDLSCs增殖及成骨能力的影响3.明确不同级别SMS对HPDLSCs和PPDLSCs破骨能力及炎症反应的影响4.寻找促进HPDLSCs和PPDLSCs再生能力的最佳SMS力值研究方法1.采用低密度接种法分离培养HPDLSCs和PPDLSCs,流式细胞仪检测细胞表面间充质干细胞标记物的表达,克隆形成能力检测细胞增殖活性,茜素红染色检测细胞成骨能力;2.使用Flexcell Tension Unit对HPDLSCs和PPDLSCs进行6%、8%、10%、12%、14%的SMS加载;3.在不同级别SMS加载后,使用流式细胞仪检测HPDLSCs和PPDLSCs的细胞周期,MTT检测HPDLSCs和PPDLSCs的细胞活性,ALP染色、ALP活性检测、茜素红染色、实时定量RT-PCR检测HPDLSCs和PPDLSCs的成骨能力;4.在不同级别SMS加载后,实时定量RT-PCR检测HPDLSCs和PPDLSCs中破骨基因Rankl和C-fos的表达,Elisa检测HPDLSCs和PPDLSCs中炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的分泌情况。实验结果1.HPDLSCs和PPDLSCs均强阳性表达间充质干细胞表面标记物Stro-1、CD146、CD90和CD29,阴性表达造血系标记物CD31和CD14,同时,Stro-1、CD146、CD90和CD29在HPDLSCs中的表达比率均显著高于在PPDLSCs。克隆形成能力检测显示HPDLSCs的克隆形成率为37%,PPDLSCs的克隆形成率为64%。茜素红染色结果证实HPDLSCs和PPDLSCs均可以形成矿化结节,其中HPDLSCs形成的矿化结节较PPDLSCs多且面积大。2.细胞周期和MTT实验结果显示,在未加力情况下,PPDLSCs的增殖能力明显高于HPDLSCs;而在牵张力加载后,从6%到14%的SMS对HPDLSCs的增殖能力均产生了促进作用,其中12%的力值促进作用最佳;对于PPDLSCs,只有6%和8%的SMS能够促进其增殖,其中8%的力值效果更优;当SMS大于8%时,PPDLSCs的增殖能力随力值增加而显著下降。ALP染色、ALP活性检测、茜素红染色和实时定量RT-PCR结果一致显示,在未加力情况下,PPDLSCs的成骨能力低于HPDLSCs,而在SMS加载后,HPDLSCs中各项成骨指标均显著上调,其中12%SMS对HPDLSCs的成骨作用促进能力最强;而对于PPDLSCs,8%SMS能最大程度促进其成骨能力,当力值大于8%时,会对PPDLSCs的成骨能力产生明显的抑制作用。3.实时定量RT-PCR检测加力组和对照组HPDLSCs及PPDLSCs中Rankl、C-fos的表达,结果显示,在未加力情况下,PPDLSCs中Rankl和C-fos的表达水平明显高于HPDLSCs;而在牵张力加载后,当力值低于12%时,HPDLSCs中Rankl和C-fos的表达水平较未加力时无明显变化;当力值大于12%时,Rankl和C-fos的表达显著上调;在PPDLSCs组,当力值低于8%时,Rankl和C-fos的表达无明显变化,当力值大于8%时,可明显激活两种破骨基因的表达。Elisa检测结果显示,PPDLSCs中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表达水平均高于HPDLSCs;在SMS加载后,HPDLSCs和PPDLSCs中IL-1β和TNF-α的表达水平略有升高,但不同力值对炎症因子的表达无明显差异,而在SMS加载后IL-6和IL-8的表达水平发生了大幅上调;在HPDLSCs组,当力值低于12%时,加力组各组间IL-6和IL-8的表达水平无明显差异,但当力值高于12%时,IL-6和IL-8的表达水平显著上升;而在PPDLSCs组,6%和8%的牵张力值对IL-6和IL-8的表达影响基本无区别,但当力值大于8%,IL-6和IL-8的表达会随着力值的增大而逐渐增强。结论1.HPDLSCs和PPDLSCs均表达间充质干细胞标记物,具有自我更新和多向分化潜能;但牙周病微环境刺激了PPDLSCs的增殖能力、损害了其间充质干细胞表达率和成骨能力;2.HPDLSCs和PPDLSCs对SMS的反应不同,炎症微环境使得PPDLSCs的力学敏感性增强,耐受性减弱;过大的静态牵张力会导致PPDLSCs的增殖能力降低,成骨破骨平衡被破坏,炎症反应被激活;3.从促进牙周再生和组织改建的角度,施加于HPDLSCs的最佳SMS力值为12%,PPDLSCs的最佳SMS为8%。第二部分12%SMS作用下HPDLSCs和PPDLSCs中Lnc RNA芯片表达谱研究研究目的1.筛选12%SMS作用下HPDLSCs和PPDLSCs中差异表达的Lnc RNA2.对HPDLSCs和PPDLSCs中Lnc RNA的差异表达情况及功能进行分析研究方法1.12%SMS加载后,TRIzol提取HPDLSCs和PPDLSCs总RNA,RNasey Mini Kit对RNA进行纯化,分光光度计检测对样本RNA进行质检及浓度测定,琼脂糖凝胶电泳检测样本完整性以及是否被g DNA污染,合成并纯化c DNA后Nano Drop ND-1000检测其质量,Nimble Gen Hybridization系统和Nimble Gen wash buffer进行芯片杂交洗涤,Axon Gene Pix 4000B进行芯片扫描,Nimble Scan software和Agilent Gene Spring GX software进行图像数据分析。2.利用KEGG生物学通路分析、GO分析、CNC分析对差异表达的Lnc RNA进行功能分析3.实时定量PCR验证Lnc RNA芯片的可信度实验结果1.分光光度计检测结果显示,HPDLSCs和PPDLSCs样本中提取的RNA吸光度值均在1.8-2.1之间,接近2.0。琼脂糖凝胶电泳检测显示各样本所提取RNA无g DNA污染,无明显降解,可以用于后续芯片实验。箱图结果可见6个细胞样本芯片荧光信号的强度一致,因此不会因信号不一致而导致结果不可靠。散点图、火山图、聚类图直观的显示出HPDLSCs和PPDLSCs在牵张力加载后存在大量差异表达的Lnc RNA。2.在12%SMS加载后变化倍数>2且有统计学意义的Lnc RNA在HPDLSCs中有8847种,PPDLSCs中有9772种,在HPDLSCs和PPDLSCs中共同表达的Lnc RNA有7223种;而仅在HPDLSCs加力后发生变化的为1624种,其中表达倍数>20倍的为27种（均为上调）;仅在PPDLSCs加力后表达发生变化的为2549种,其中表达倍数>20倍的为16种（9种上调,7种下调）。3.KEGG生物学通路分析显示在HPDLSCs中差异表达的生物学通路包括脂肪酸降解通路、MAPK信号通路、血管平滑肌收缩通路、脂肪酸代谢通路、淀粉和蔗糖代谢通路、叶酸碳库通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路、矿化吸收通路、钙离子信号通路、内质网蛋白加工通路;而在PPDLSCs中差异表达的生物学通路包括鞘脂类代谢通路、可卡因成瘾通路、Erb B信号通路、亨廷顿氏舞蹈病通路、赖氨酸生物合成通路、B细胞受体信号通路、膀胱癌通路、同源重组通路、非小细胞肺癌通路、非酒精脂肪肝疾病通路。GO分析结果显示在HPDLSCs中差异表达的BP（biological process）条目有多个与力学刺激和细胞外信号转导相关,例如response to stress、regulation of response to stimulus等;而在PPDLSCs中这些通路条目没有出现。CNC分析结果显示,差异表达最为显著的10个Lnc RNA能够与相应m RNA形成1250个共表达基因对,对这些共表达的m RNA进行KEGG分析结果显示其主要与arginine and proline mtabolism、cell adhesion molecules和leukocyte transendothelial migration通路有关。4.实时定量RT-PCR显示,随机选取的四种Lnc RNA（TCONS00008604、ENST00000428781、Uc004arq.1、ENST00000445814）表达情况与芯片结果趋势一致。结论1.本实验收集的RNA样本质检合格,可用于Lnc RNA芯片实验;2.12%SMS加载条件下HPDLSCs和PPDLSCs中存在大量差异表达的Lnc RNA;3.HPDLSCs中差异表达m RNA涉及的生物学通路大都为正常生物学反应通路,而PPDLSCs中差异表达m RNA涉及的生物学通路多数与疾病相关;4.在HPDLSCs中差异表达显著的与力学刺激和细胞外信号传导相关通路在PPDLSCs中未发生明显变化,说明牙周炎微环境可能导致PPDLSCs对力学刺激的反应出现异常;5.实时定量RT-PCR结果显示四种随机选取Lnc RNA的变化趋势同芯片结果一致,其中ENST00000445814差异表达倍数达250倍,可能作为我们下一步的研究目标。