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目的: 探讨 Notch信号通路在人脐带间充质干细胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs)向软骨细胞诱导分化过程中的作用。 方法: 1.hUC-MSCs的分离、培养和鉴定:采用酶消化法从人脐带中分离hUC-MSCs,体外培养扩增;倒置显微镜观察细胞的形态特征;MTT法制作细胞的生长曲线;流式细胞术分别检测细胞周期、细胞凋亡和细胞表面标志;茜素红染色、甲苯胺蓝染色和油红O染色分别检测细胞成骨、成软骨和成脂分化能力。 2.hUC-MSCs中Notch信号的研究:收集第3代hUC-MSCs,体外诱导其向软骨细胞分化;甲苯胺蓝染色和免疫荧光染色分别鉴定蛋白聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)和Ⅱ型胶原蛋白(Collagen TypeⅡ,COL-2A1),阿利新蓝法和羟脯氨酸法分别检测它们的含量;qPCR分别检测GAG、COL-2A1以及Notch信号分子Jag-1、PS-1、Notch-1和Hes-1的基因表达水平;Western-Blot检测Notch-1蛋白的表达水平;流式细胞术检测细胞周期。 3.Notch信号在hUC-MSCs向软骨细胞诱导分化过程中的作用研究:收集第3代hUC-MSCs,体外诱导其向软骨细胞分化的同时用不同浓度的Notch信号特异性阻断剂N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-(S)-phenylglycinet-butyl ester(DAPT)处理;倒置显微镜观察细胞的形态特征;MTT法检测细胞的增殖能力;甲苯胺蓝染色和免疫荧光染色分别鉴定GAG和COL-2A1,阿利新蓝法和羟脯氨酸法分别检测它们的含量;qPCR分别检测GAG、COL-2A1以及Notch信号分子的基因表达水平;Western-Blot检测Notch-1蛋白的表达水平;流式细胞术检测细胞周期。 结果: 1.酶消化法从人脐带中分离获得的细胞体外培养至第3代时,其形态基本为间充质干细胞典型的长梭形,且第4、5代的形态基本不变;第3代细胞的增殖能力强,生长迅速,约有25.4％的细胞处于分裂的G2/S期,而凋亡率仅为6%;细胞CD13、CD44和CD105的阳性率分别为100%、100%和99.9%,而CD11b、CD34、CD45以及HLA-DR的阴性率分别为0.01%、0.02%、0.01%和0.01%,并具有成骨、成软骨和成脂分化能力。 2.与无添加诱导剂的对照组相比,诱导组的甲苯胺蓝染色和免疫荧光染色均呈阳性,且染色随着时间逐渐加深;在第6天、12天和18天,GAG的含量分别为12.39±1.39μg/ml、18.66±1.88μg/ml、25.91±4.08μg/ml,COL-2A1的含量分别为97.18±9.84μg/ml、117.2±3.75μg/ml、195.64±3.31μg/ml;qPCR结果显示GAG和COL-2A1的基因表达水平随着时间也逐渐增加,而Jag-1、PS-1、Notch-1和Hes-1的基因表达水平明显下降(p<0.01);Western-Blot结果显示Notch-1蛋白的表达随着时间逐渐下降,而处于分裂静止G1期的细胞比例逐渐上升,分别为70.9%、77.9%和90%。 3.诱导组、DMSO组和各浓度DAPT组的细胞形态由长梭形逐渐变成接近软骨细胞的多边形,MTT结果显示各组的细胞数量在第5天达到顶峰;各组的甲苯胺蓝染色和免疫荧光染色均呈阳性,且染色随着时间逐渐加深;各组GAG和COL-2A1的含量测定以及基因表达水平检测也表明GAG和COL-2A1的表达随着时间逐渐增加,且在第18天,诱导组、DMSO组以及0.5μM、1μM和5μM DAPT组的GAG含量分别为25.91±4.08μg/ml、26.89±1.31μg/ml、21.13±0.92μg/ml、17.63±0.18μg/ml、16.23±0.32μg/ml,COL-2A1含量分别为195.64±3.31μg/ml、203.42±7.31μg/ml;208.12±13.65μg/ml、185±1.94μg/ml、139.36±4.63μg/ml;qPCR结果显示,与诱导组相比,各浓度DAPT组Notch信号分子的基因表达水平都下降;Western-Blot结果显示诱导组、DMSO组和各浓度DAPT组Notch-1蛋白的表达水平随着时间下降,且各浓度DAPT组下降更明显,而各组第18天G1期的细胞比例分别为90%、91.9%、88.5%、87.9%和87%。 结论: 1.酶消化法从人脐带中分离获得的细胞活性好,纯度高,生长迅速,增殖旺盛,符合间充质干细胞的特征,可用于后续的实验研究; 2.Notch信号通路存在于hUC-MSCs中,它可保持细胞的增殖活性,一旦诱导hUC-MSCs向软骨细胞分化,Notch信号表达水平下降; 3.本课题中hUC-MSCs向软骨细胞诱导分化的Notch信号表达水平可能比较适合GAG的表达,但还不是COL-2A1表达的最佳水平,进一步适当降低Notch信号表达水平在一定时间内有利于COL-2A1的表达,但过低的Notch信号表达水平又会阻碍其表达。