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心力衰竭是心血管疾病的最终阶段,作为发病率及患病率均逐年增加的心血管综合征,已严重威胁人类公共健康。其中,心肌细胞的凋亡增加是心衰发生发展的关键因素。据报道,持续的心肌细胞凋亡可引起细胞丢失增加,进而引起心功能的恶化,最终导致心衰,故探讨心肌细胞的凋亡机制尤为重要。临床数据表明,40%-60%心衰患者的血清中,β1-肾上腺素受体自身抗体（β1-AA）含量明显增加,它可通过特异性激活心肌细胞膜β1-肾上腺素受体（β1-AR）引起细胞凋亡,进而参与心衰的发生发展。然而其具体机制目前不清,仍需进一步探讨。大量研究发现,适当的自噬对于细胞内环境稳态维持至关重要,自噬障碍往往先于并调控细胞凋亡发生。我们课题组前期研究发现,β1-AA可通过抑制心肌细胞自噬进而促进凋亡的发生,利用雷帕霉素（Rapa）上调自噬可部分缓解心肌细胞的凋亡增加。然而β1-AA诱导心肌细胞自噬降低的具体机制仍不明确。相关研究表明,细胞中内质网应激（ERS）与自噬关系密切。ERS激活可诱导未折叠蛋白反应（UPR）,消除某些不利因素对细胞内的稳态进行调节。应力条件下,适当的ERS可通过激活细胞内自噬水平发挥稳态维持作用,上调的自噬则可激活ERS相关存活机制,反之,若此时ERS持续激活且较为严重,使得细胞不能适应外界刺激,则会诱导细胞自噬水平显著降低,而细胞自噬抑制后则会进一步激活ERS相关促凋亡机制进而诱导细胞凋亡。由此可知,在细胞的稳态维持过程中,ERS与自噬的交互作用至关重要。那么,在β1-AA持续作用下,心肌细胞中是否也存在ERS与自噬之间的交互作用,该交互作用是否作为重要机制参与其诱导的细胞凋亡呢?这也是本研究重点探讨的问题。本研究采用β1-AR细胞外的第二环抗原肽段（β1-AR-ECII）主动免疫雄性SD大鼠建立主免模型,利用SA-ELISA法对主免大鼠血清中β1-AA抗体的OD值进行检测,并于主免后第8周,用亲和层析法对大鼠血清中的β1-AA进行提纯。通过Real-time PCR,Western blot,mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒,免疫组化检测大鼠的心肌组织及H9c2心肌细胞的自噬水平及ERS变化情况;利用TUNEL染色,Annexin V-FITC/PI双染法及Caspase-3活性法检测心肌组织及H9c2心肌细胞的凋亡情况;利用CCK-8法对心肌细胞的存活率进行检测。结果发现β1-AA可诱导心肌组织及心肌细胞的自噬水平明显降低及ERS持续激活,采用Rapa上调心肌细胞的自噬水平或4-苯基丁酸（4-PBA）抑制心肌细胞的ERS,均可部分缓解β1-AA诱导的细胞凋亡,提示自噬抑制和ERS激活均参与β1-AA引起的心肌细胞凋亡。进一步,利用4-PBA抑制心肌细胞ERS,观察其对细胞自噬功能的影响,结果发现,β1-AA可通过引起心肌细胞ERS激活进而诱导细胞自噬障碍;通过3-甲基腺嘌呤（3MA）及Rapa抑制或上调细胞的自噬水平,观察其对细胞ERS的作用,结果表明,自噬功能障碍可反过来进一步激活细胞的ERS。由此可见,ERS与自噬交互作用在β1-AA诱导的心肌细胞凋亡过程中十分重要。鉴于β1-AA诱导的心肌细胞凋亡过程中ERS与自噬的交互作用,本研究进一步利用Rapa和4-PBA联合调整ERS及自噬观察β1-AA诱导的心肌细胞凋亡的变化情况,旨在为改善β1-AA阳性心衰患者的病情进展及预后提供相应的理论基础。第一部分自噬降低参与β1-AA诱导的心肌细胞凋亡增加研究目的:建立主动免疫大鼠模型并提纯β1-AA,作用于H9c2心肌细胞,在体水平及离体水平探讨自噬降低在β1-AA诱导的心肌细胞凋亡中的作用。研究方法:（1）建立主动免疫大鼠模型:利用β1-AR-ECII对健康成年雄性SD大鼠进行主动免疫。将大鼠随机分成主动免疫组及溶剂对照组,肽段以0.4μg/g的剂量对大鼠进行背部皮下多点注射,每两周加强免疫一次,溶剂对照组采用Na2CO3溶液代替抗原肽段。于主免0 w,2 w,4 w及8 w后进行鼠尾取血,采用SA-ELISA法检测血清中β1-AA抗体产生情况。若大鼠血清中β1-AA含量明显上调且稳定于较高水平,则可利用亲和层析法提纯血清中的β1-AA用于后续H9c2心肌细胞实验;（2）Real-time PCR检测主免大鼠心肌组织及β1-AA作用于H9c2心肌细胞后自噬相关基因Beclin1及LC3的mRNA含量变化;（3）Western blot检测主免大鼠心肌组织及β1-AA作用于H9c2心肌细胞后自噬相关蛋白Beclin1,LC3及p62的蛋白水平变化;（4）mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒检测β1-AA作用后H9c2心肌细胞自噬流的变化;（5）Rapa腹腔注射上调大鼠心肌组织自噬,TUNEL染色法检测β1-AA作用下大鼠心肌组织凋亡率的变化;（6）3MA预处理抑制H9c2心肌细胞自噬,Rapa预处理上调细胞自噬,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测β1-AA作用下心肌细胞凋亡的变化。研究结果:（1）主动免疫大鼠模型建立成功:与对照组相比,β1-AA主动免疫2周时大鼠血清中抗体OD值已明显增加,且随着主动免疫时间的延长大鼠血清中β1-AA抗体含量逐渐升高,6周时即达到较高水平,并持续至第8周,提示主免大鼠模型建立成功;（2）β1-AA主动免疫大鼠心肌组织自噬水平显著降低:Real-time PCR及Western blot结果表明,与对照组相比,主动免疫2周后,大鼠心肌组织Beclin1及LC3的mRNA及蛋白水平均明显下降,随着主动免疫时间的延长持续降低,8周时最低,自噬底物p62蛋白含量在主免2周后逐渐增加,且持续至第8周;（3）β1-AA引起H9c2心肌细胞自噬水平显著降低:Real-time PCR及Western blot结果表明β1-AA作用6 h后即可引起Beclin1及LC3 mRNA及蛋白表达明显降低,持续至24 h,而自噬底物p62蛋白表达在β1-AA作用12 h后才出现明显增加;mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒感染细胞,结果显示,在β1-AA作用6 h后,自噬小体与自噬溶酶体的含量均出现明显降低,提示自噬流降低,且持续至24 h;（4）自噬降低参与β1-AA诱导的心肌细胞凋亡增加:TUNEL染色结果表明,利用Rapa对大鼠进行腹腔注射预处理上调心肌组织自噬水平后,可部分缓解β1-AA主动免疫诱导的大鼠心肌组织凋亡增加,利用Rapa预处理H9c2心肌细胞同样可部分缓解β1-AA引起的细胞凋亡增加,而3MA则进一步诱导心肌细胞凋亡增加。结论:自噬降低参与β1-AA诱导的心肌细胞凋亡增加。第二部分内质网应激参与β1-AA诱导的心肌细胞自噬降低研究目的:检测β1-AA长期存在时心肌组织及H9c2心肌细胞内质网应激变化规律及其在自噬降低中的作用。研究方法:（1）Real-time PCR检测主免大鼠心肌组织及β1-AA作用于H9c2心肌细胞后内质网应激相关基因GRP78,CHOP及Caspase-12的m RNA水平变化;（2）Western blot检测主免大鼠心肌组织及β1-AA作用于H9c2心肌细胞后内质网应激相关蛋白GRP78,CHOP及Caspase-12的蛋白水平变化;（3）免疫组化检测主免大鼠心肌组织及β1-AA作用于H9c2心肌细胞后内质网应激相关蛋白GRP78,CHOP及Caspase-12蛋白原位表达情况;（4）Real-time PCR,Western blot及m RFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒检测4-PBA预处理后H9c2心肌细胞自噬水平变化。研究结果:（1）β1-AA主动免疫大鼠心肌组织内质网应激显著激活:Real-time PCR,Western blot及免疫组化结果表明主动免疫2周后,大鼠心肌组织GRP78的m RNA及蛋白水平均明显增加,CHOP及Caspase-12则于主免4周后显著上调,随着主动免疫时间的延长,心肌组织内质网应激持续激活;（2）β1-AA诱导H9c2心肌细胞内质网应激明显激活:Real-time PCR,Western blot及免疫组化结果均表明β1-AA作用6 h后心肌细胞内质网应激即被明显激活,且随着β1-AA作用时间的延长,内质网应激被持续激活,并持续至24 h;（3）内质网应激参与β1-AA诱导的H9c2心肌细胞自噬降低:Real-time PCR,Western blot及m RFP-GFP-LC3腺病毒结果均表明,利用4-PBA抑制心肌细胞内质网应激,可引起细胞Beclin1及LC3表达显著增加,p62含量明显降低,且自噬流明显上调。结论:内质网应激激活参与β1-AA诱导的心肌细胞自噬降低。第三部分β1-AA诱导的自噬降低激活心肌细胞内质网应激研究目的:探讨β1-AA诱导的自噬降低是否激活心肌细胞内质网应激,明确内质网应激与自噬的交互作用在β1-AA诱导的心肌细胞凋亡中的影响。研究方法:（1）Western blot检测对照组,β1-AA组（24 h）,3MA+β1-AA组,Rapa+β1-AA组H9c2心肌细胞自噬相关蛋白Beclin1,LC3,p62以及内质网应激相关蛋白GRP78,CHOP,Caspase-12的蛋白表达变化;（2）4-PBA抑制心肌细胞内质网应激,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测β1-AA作用下心肌细胞凋亡率变化;（3）4-PBA抑制心肌细胞内质网应激,采用CCK-8法检测β1-AA作用下心肌细胞存活率变化;（4）Real-time PCR检测对照组,β1-AA组,4-PBA预处理组,Rapa预处理组及4-PBA+Rapa预处理组H9c2心肌细胞自噬相关基因Beclin1及LC3的m RNA含量变化;（5）Western blot检测对照组,β1-AA组（12 h）,4-PBA预处理组,Rapa预处理组及4-PBA+Rapa预处理组H9c2心肌细胞自噬相关蛋白Beclin1,LC3及p62蛋白表达变化;（6）m RFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒检测对照组,β1-AA组（12 h）,4-PBA预处理组,Rapa预处理组及4-PBA+Rapa预处理组自噬流变化;（7）Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术及Caspase-3活性检测法检测对照组,β1-AA组（12 h）,4-PBA预处理组,Rapa预处理组及4-PBA+Rapa预处理组H9c2心肌细胞凋亡率变化。研究结果:（1）β1-AA诱导的自噬降低激活心肌细胞内质网应激:与β1-AA组相比,利用3MA抑制心肌细胞自噬可进一步上调GRP78,CHOP及Caspase-12蛋白表达,利用Rapa上调心肌细胞自噬水平则可明显缓解β1-AA诱导的内质网应激激活;（2）抑制内质网应激可部分缓解β1-AA诱导的心肌细胞凋亡增加及存活率降低:流式细胞术及CCK-8结果表明,采用4-PBA抑制心肌细胞内质网应激可明显缓解β1-AA诱导的心肌细胞凋亡增加及存活率降低,但不能完全缓解;（3）4-PBA及Rapa联合处理可进一步上调心肌细胞自噬水平:Real-time PCR,Western blot及自噬双标腺病毒结果均表明,与4-PBA及Rapa单独预处理组相比,4-PBA+Rapa联合预处理可进一步引起Beclin1,LC3蛋白及自噬流水平增加,p62表达降低;（4）4-PBA及Rapa联合处理可进一步缓解β1-AA诱导的心肌细胞凋亡:流式细胞术及Caspase-3活性检测结果均表明,单独采用4-PBA抑制内质网应激或Rapa上调细胞自噬均仅可部分缓解β1-AA诱导的细胞凋亡增加,与4-PBA及Rapa单独预处理组相比,4-PBA+Rapa联合预处理可进一步缓解β1-AA诱导的心肌细胞凋亡增加,且于β1-AA作用12 h时最为明显。结论:β1-AA诱导的自噬降低激活心肌细胞内质网应激。