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目的： 阿尔茨海默病(Alzheimers disease， AD)是一种年龄相关的神经系统退行性疾病，最终发展为进行性痴呆，AD的主要神经病理特征是细胞外存在大量由β淀粉样蛋白(beta-amyloid protien，Aβ)高度聚集形成的老年斑(senile plaques，SP)、神经细胞内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)、神经元缺失以及皮质动脉和小动脉的血管淀粉样变性。其发病原因复杂，至今尚未完全阐明。目前认同的观点是:Aβ的水平是由其产生和清除之间的平衡决定的;Aβ在脑内的沉积是AD发病的早期过程和中心环节。发病早期活化的小胶质细胞可以清除Aβ，随着病情进展，这种由小胶质细胞介导的炎症反应将成为慢性的神经毒性，产生大量的有害因子，导致神经元死亡。 总体来说，Aβ的水平是由其产生和清除之间的平衡决定的，若Aβ的清除障碍导致脑内形成沉积斑块。 巨噬细胞和小胶质细胞是体内固有的免疫细胞，可以清除病原体及有害代谢产物，有研究显示AD病人的血源性单核/巨噬细胞能够穿过血脑屏障迁移入脑，但不能有效清除炎性斑块内的Aβ。而AD患者脑内固有的小胶质细胞虽然呈现炎症、吞噬及致炎反应的特征，但并不具备吞噬能力。以APP转基因小鼠为模AD型进行的研究表明，绝大多数浸润到脑内Aβ斑块周围的小胶质细胞来源于骨髓;而非脑内固有小胶质细胞。由此看来，AD患者及APP转基因小鼠脑内固有的小胶质细胞虽然对Aβ沉积呈现出了炎性反应，而血源性巨噬细胞却不能有效清除Aβ。所以得出结论:AD患者先天性免疫功能缺陷可能是脑内Aβ沉积引发炎性反应的主要原因。 发病早期，小胶质细胞在AD病人脑内聚集能够促进Aβ的清除、延缓病情进展，然而尽管随着病情进展，入脑的小胶质细胞数量不断增加，但最终还是形成Aβ斑块，提示这些迁移入脑的骨髓源性小胶质细胞对于Aβ的清除能力有所下降。 那么对于AD患者，其外周血单核细胞为什么不能同样有效地清除Aβ从而达到限制病程进展的目的？我们通过采集30个AD患者及26个同年龄健康对照者的外周血并分离单核细胞，进行mRNA的基因芯片分析，旨在对AD病人和正常老年人外周血单核细胞基因表达谱的差异进行研究，同时筛选有意义的基因，研究其在AD病人外周血单核细胞表达异常的病理意义。 方法： 1、筛选AD病人及同年龄健康对照者外周血单核细胞中表达差异的基因 (1) AD病人外周血单核细胞的分离:选取沈阳地区AD病30例，同年龄健康对照26例，用肝素抗凝处理过的试管，于清晨空腹采肘静脉血，室温放置，采血后3h内用分离人外周血单核细胞的Dynabeads(R)CD14磁珠试剂盒分离人外周血单核细胞，用Trazol裂解后提取总RNA并委托公司进行基因芯片检测。 (2)根据芯片检测结果，筛选有表达差异的基因，并选取其中的Cathepsin D和Cystatin F基因进行研究。 2、AD病人外周血单核细胞Cathepsin D表达异常对Aβ降解的影响 (1)采用定量PCR方法验证AD病人外周血单核细胞中Cathepsin D基因表达的变化。 (2)分别采集5个AD病人及5个健康对照者外周血，免疫磁珠法分离人外周血单核细胞，用Cathepsin D activity assay kit测定Cathepsin D活性变化。 (3)以Cathepsin D的抑制剂Pepstatin A处理THP-1和U937后，观察其活性变化。 (4)采用ELISA方法检测Pepstatin A处理后THP-1对于Aβ的降解的影响。 (5)利用慢病毒载体，构建特异性Cathepsin D基因沉默的RNA干扰质粒，制备得到高滴度的慢病毒颗粒。 (6)用慢病毒颗粒转染单核细胞THP-1，建立Cathepsin D基因低表达的单克隆细胞系。 (7)采用ELISA方法检测低表达Cathepsin D的单核细胞对于Aβ降解的影响。 (8)采用免疫组化方法分析低表达Cathepsin D单核细胞对于APP/PS1小鼠脑片内Aβ清除的影响。 3、探讨Cathepsin D基因表达异常是否为代偿性改变 (1)利用本课题组建立的脑内沉积Aβ的大鼠动物模型（即在大鼠海马部位注入Aβ1-42后成功观察到大鼠脑内Aβ沉积），我们在大鼠海马部位注入Aβ1-42术后3d和7d分别采集外周血并分离单核细胞。 (2)采用定量PCR方法检测大鼠外周血单核细胞中Cathepsin D表达的变化。 4、AD病人外周血单核细胞Cystatin F基因表达异常对Aβ降解的影响 (1)采用定量PCR方法验证AD病人外周血单核细胞中Cystatin F表达的变化。 (2)利用慢病毒载体，构建特异性Cystatin F基因沉默的RNA干扰质粒，制备得到高滴度的慢病毒颗粒。 (3)利用慢病毒载体，构建特异性Cystatin F基因高表达的RNA干扰质粒，制备得到高滴度的慢病毒颗粒。 (4)用慢病毒颗粒转染单核细胞的模式细胞U937/THP-1，建立Cystatin F基因沉默或高表达的单克隆细胞系。 (5)采用ELISA方法检测特异性Cystatin F基因沉默对于Aβ降解的影响。 (6)采用免疫组化方法检测特异性Cystatin F基因过表达对于APP/PS1小鼠脑内Aβ清除的影响。 结果： 1、筛选出AD病人和同年龄对照者外周血单核细胞中表达差异的基因 (1)与同龄对照者相比，AD病人Cathepsin D基因表达下调、活性下降。 (2)与同龄对照者相比，AD病人Cystatin F基因表达上调。 2、 Cathepsin D表达下调不利于单核细胞对Aβ的降解 (1)经Cathepsin D抑制剂Pepstatin A处理后，THP-1/U937中Cathepsin D活性下降。 (2)Pepstatin A能抑制THP-1/U937对于Aβ的降解。 (3)慢病毒介导特异性Cathepsin D基因沉默THP-1单克隆细胞株对于Aβ的降解能力下降。 (4)慢病毒介导特异性Cathepsin D基因沉默THP-1单克隆细胞对于AD小鼠脑片内Aβ斑块的清除能力下降。 (5)脑内沉积Aβ的大鼠动物模型外周血单核细胞中Cathepsin D表达无明显变化。 3、 Cystatin F表达异常能够影响U937/THP-1对于Aβ的降解 (1)慢病毒介导特异性Cystatin F基因沉默U937单克隆细胞株对于外源性Aβ的降解能力下降。 (2)慢病毒介导Cystatin F高表达THP-1单克隆细胞株能促进对外源性Aβ的降解。 (3)慢病毒介导特异性Cystatin F基因过表达THP-1单克隆细胞有助于AD小鼠脑片内Aβ斑块的清除 结论： 1、 AD患者外周血单核细胞中Cathepsin D表达下调、活性下降，而Cystatin F表达上调; 2、 Cathepsin D表达下调不利于单核细胞对Aβ的降解及清除，而CystatinF表达上调能促进单核细胞对Aβ的降解及清除; 3、 AD病人Aβ清除障碍可能与Cathepsin D和Cystatin F表达异常有关。