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目的:本实验基于中医基础“气为血之帅,血为气之母”理论,选取中医经典气血双补方剂当归补血汤的有效组份当归多糖和黄芪多糖为干预药物,以当归多糖、黄芪多糖以及联合用药为实验组,以重组人促红细胞生成素为阳性药物对照组,以腹腔注射环磷酰胺致骨髓抑制小鼠造血干细胞为实验对象,着重观察当归多糖、黄芪多糖以及联合用药对骨髓抑制小鼠造血的影响,从JAK2-STAT5信号通路途径以及影响造血的细胞因子入手,探讨当归多糖、黄芪多糖以及联合用药的可能造血机制。材料与方法:采用环磷酰胺380mg/kg腹腔注射法建立血虚状态模型小鼠。按照随机平行对照方法,将60只清洁级C57BL/6小鼠编号,按随机数字表法随机分为6组,正常组、模型组、重组人促红细胞生成素组、当归多糖组、黄芪多糖组、当归多糖+黄芪多糖组,10只/组。实验第1d,各组小鼠称体重,模型组、重组人促红细胞生成素组、当归多糖组、黄芪多糖组组、当归多糖+黄芪多糖组,腹腔注射环磷酰胺380mg/kg·d-1,连续3d,正常组注射等量生理盐水。造模3d后将存活造模小鼠重新编号分组,最终分组为,正常组10只,模型组、重组人促红细胞生成素组、当归多糖组、黄芪多糖组、当归多糖+黄芪多糖组各8只。实验第4d(造模后第1d),颈椎脱臼处死小鼠,无菌取股骨和胫骨,提取小鼠骨髓造血干细胞,置入培养基中,调整细胞浓度为1×10 5/m L,其次将干预药物加入相应的培养基中,然后将混合液加入96孔板(200u L)/孔和24孔板(1L/孔)中,每组设3个复孔,周围孔分别加入相应量的无菌超纯水,将细胞板置于5%CO2,37℃孵育箱中培养。实验第1d和第4d(造模第1d和造模第4d)血常规观测小鼠外周血象、实验第5-7d(细胞培养1-3d)MTT法观测细胞增殖率,实验第11d(细胞培养7d)免疫蛋白法检测细胞因子EPO、IL-3、IL-6和RT-PCR法检测细胞内转录因子JAK2、STAT5的表达。结果:1模型复制鉴定实验第3d(造模第3d),造模小鼠出现饮食下降,行动迟缓,排泄减少并见粪便变软,精神萎靡,面、眼、耳、尾苍白,毛蓬竖而少光泽,体重下降等现象;小鼠外周血象,造模组小鼠红细胞、白细胞、血红蛋白均低于造模前和正常组,提示成功复制血虚模型。2小鼠骨髓造血细胞生长情况观测细胞培养1d后,光镜下可见细胞数量增多;细胞培养3d后,少量细胞集落形成,由8个左右细胞组成,且细胞较小,形态一致,圆形;细胞培养5d后,细胞数量增多明显,且大量细胞集落形成,每个细胞集落的细胞数较多,最多细胞数可达40个左右。其中部分集落细胞大小均匀,形态一致,呈圆形,为红单系造血祖细胞集落(CFU-E);部分集落由无色细胞团块组成,细胞分散,有密集型和疏散型,为粒单系造血祖细胞集落(CFU-GM)。细胞培养7d,细胞体积与集落均变小,细胞弥散与培养基中。3当归多糖、黄芪多糖以及联合用药对造血干细胞增殖率的影响3.1造血干细胞生长曲线绘制模型组造血干细胞生长曲线大体呈反S形,细胞培养第24h,细胞生长缓慢,并且细胞有死亡现象;细胞培养第48h,细胞生长增快;细胞培养第72h,细胞生长情况与第24h相似。其余各组造血干细胞生长曲线大体呈S形,细胞培养第24h,快速增殖,细胞培养第48h,细胞生长进入对数生长期,并达到最高峰;细胞培养第72h,细胞生长减慢,进入平稳期。3.2当归多糖、黄芪多糖以及联合用药对造血干细胞增殖的影响细胞培养24h、48h和72h,用MTT法观测细胞增殖情况,结果显示,各时间各培养体系中造血干细胞均有增殖。与模型组相比,正常组、重组人促红细胞生成素组、当归多糖组、黄芪多糖组、当归多糖+黄芪黄芪多糖组细胞增殖均升高(P<0.01);与正常组相比,细胞培养第24h后,重组人促红细胞生成素组、当归多糖组、黄芪多糖组、当归多糖+黄芪多糖组细胞增殖均升高(P<0.05或P<0.01),组间相比无显著性差异(P>0.05)。4当归多糖、黄芪多糖以及联合用药对细胞因子EPO、IL-3和IL-6表达的影响细胞培养7d,免疫蛋白法检测细胞因子EPO、IL-3和IL-6表达情况,结果显示,各培养体系中细胞因子EPO、IL-3和IL-6均有表达。与模型组相比,其余各组细胞因子IL-3、EPO和IL-6表达显著升高(P<0.01);与正常组相比,各药物干预组细胞因子IL-3、EPO表达显著升高(P<0.01),细胞因子IL-6表达无显著差异(P>0.05);与重组人促红细胞生成素组相比,当归多糖组和黄芪多糖组细胞因子IL-3、EPO表达显著降低(P<0.01),细胞因子IL-6表达无显著差异(P>0.05);当归多糖+黄芪多糖组细胞因子IL-3、EPO和IL-6表达显著升高(P<0.01);与当归多糖组相比,黄芪多糖组细胞因子IL-3、EPO活性显著降低(P<0.01),细胞因子IL-6表达无显著差异(P>0.05);当归多糖+黄芪多糖组细胞因子IL-3、EPO和IL-6表达显著升高(P<0.01);与黄芪多糖组相比,当归多糖+黄芪多糖组细胞因子IL-3、EPO、IL-6表达显著升高(P<0.01)。5当归多糖、黄芪多糖以及联合用药对细胞内转录因子JAK2、STAT5表达的影响细胞培养7d,RT-PCR法检测单核细胞STAT5、JAK2m RNA的表达,结果显示,各培养体系中细胞内转录因子STAT5、JAK2均有表达。与模型组相比,其余5组细胞内STAT5、JAK2表达均升高(P<0.05);与正常组相比,各干预药物组细胞STAT5、JAK2表达均升高,(P<0.01或P<0.05);与重组人促红细胞生成素组相比,当归多糖组细胞内转录因子STAT5和JAK2表达均无显著差异,(P>0.05);黄芪多糖组STAT5和JAK2表达均明显降低(P<0.01);当归多糖+黄芪多糖组STAT5表达显著升高(P<0.01),JAK2表达无显著差异(P>0.05);与当归多糖组相比,黄芪多糖组细胞STAT5表达无显著差异(P>0.05);JAK2表达显著降低(P<0.05);当归多糖+黄芪多糖组JAK2表达无显著差异(P>0.05);STAT5表达显著升高(P<0.01);与黄芪多糖组相比,当归多糖+黄芪多糖组JAK2和STAT5表达均有显著升高(P<0.01)。结论:1当归多糖、黄芪多糖及联合用药对小鼠造血干细胞增殖的影响当归多糖、黄芪多糖及联合用药可促进小鼠HSCs增殖,并且当归多糖黄芪多糖联合用药效果明显。2当归多糖、黄芪多糖以及联合用药对细胞因子表达的影响当归多糖、黄芪多糖以及联合用药对细胞因子EPO、IL-3和IL-6表达均有促进作用,其中当归多糖和黄芪多糖联合用药效果最佳。3当归多糖、黄芪多糖以及联合用药对细胞内转录因子JAK2、STAT5表达的影响当归多糖、黄芪多糖以及联合用药均可刺激细胞内转录因子JAK2、STAT5的表达。且当归多糖和黄芪多糖联合用药效果最佳。说明当归多糖、黄芪多糖的补血机制可能是通过JAK2/STAT5信号通路调控造血造血/祖干细胞向红系增殖分化。