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前言 干细胞(Stemcell，SC)是一类具有无限自我复制能力和向多种细胞分化潜能的细胞。干细胞根据来源的不同则分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是存在于组织中的未分化细胞，该种细胞能够自我更新并能够分化形成组成该组织的细胞。在适当条件诱导下，可分化出组成该组织的各种细胞类型，替代生理性衰老细胞，在组织受损时代偿性增殖，能够维持机体的正常结构和功能。近年来，已发现造血、神经系统、表皮、肝脏、胃肠、气管等处存在成体干细胞，并证明干细胞与组织修复有密切关系。在成体干细胞的研究中，有学者发现成体干细胞能分化产生自身组织的各种成熟细胞。成体干细胞如骨髓来源干细胞可向肝脏、胰腺、肌肉和神经细胞分化;同时肌肉、神经干细胞也可以向造血细胞分化。这使得成体干细胞的研究越来越受到人们的关注。 我们曾建立5-Fu诱导离体大鼠和人气管损伤修复模型，证实气管干细胞存在于具有5-Fu抗性的G0期细胞中，并鉴定出气管干细胞标志物ABCG2。还证明了Wnt/β-catenin信号通路参与调控气管干细胞增殖分化过程。本研究采用形态学和免疫荧光染色方法观察5-Fu诱导的小鼠气管损伤修复过程中干细胞向上皮细胞分化并检测ABCG2的表达变化。 尽管我们的研究已经发现了参与大鼠气管上皮损伤修复过程的两大经典信号通路，但对于气管干细胞增殖或分化的确切调节机制还不明确，可能还存在着大量的未知蛋白构成了气管干细胞复杂的调节网络，其中的关键蛋白还有赖于一种高通量的方法去发现并进行深入研究。因此，本研究又采用了基因芯片的研究方法，对小鼠气管上皮损伤修复过程中气管干细胞内基因表达进行了分析。这为将来更深入的研究气管干细胞，用于治疗气管损伤性疾病提供实验和理论依据。 材料与方法 1、制备小鼠气管上皮损伤模型: 收集重约30克左右的昆明小鼠，雌雄不限（中国医科大学实验动物中心提供），腹腔注射10％水合氯醛0.4ml/100g，无菌条件下取出气管，剪成1-2mm宽的气管环，倒置显微镜下观察纤毛摆动良好，于DMEM/F12培养液中加入5-Fu(25mg/ml)，将小鼠气管环置于其中，5％CO2孵箱37℃培养，30min取出，PBS冲洗几次去除残余5-Fu。对照组用PBS代替5-Fu，其余同实验组。分别于去除5-Fu后0、12、24、48h各剪取2个气管环，10％中性福尔马林固定，24h后经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成4μm厚的组织切片。 2、HE染色观察各时间点气管上皮损伤修复情况: (1)甲苯Ⅰ，Ⅱ脱蜡各15min; (2)无水酒精脱二甲苯5min; (3)95％→85％→75％梯度酒精至蒸馏水; (4)苏木素染细胞核5-6min; (5)水洗，洗去残留染液; (6)1％盐酸酒精分化; (7)自来水冲洗返蓝，30min; (8)伊红染细胞浆5min，自来水洗去残留染液; (9)75％→85％→95％梯度酒精; (10)100％酒精Ⅰ，Ⅱ脱水各5min; (11)二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明各5min; (12)最后中性树胶封片，普通光镜观察并采图。 3、免疫荧光染色: 分别于诱导后0h、12h、24h、48h和对照组取出气管固定。每组分别做ABCG2免疫荧光染色。 (1)甲苯Ⅰ，Ⅱ脱蜡各15min; (2)无水酒精脱二甲苯5min，95％→85％→75％梯度酒精至蒸馏水; (3)1mol/LTris-HCl(pH10.0)缓冲液，高温高压修复抗原2min，并自然冷却至室温; (4)PBS缓冲液洗3次，5min/次; (5)滴加3％H2O2，阻断内源性过氧化物酶，37℃孵育切片30min; (6)PBS缓冲液洗3次，5min/次; (7)滴加非免疫动物血清，阻断非特异性结合，37℃孵育切片50min; (8)甩去B液，滴加一抗，4℃孵育过夜; (9)PBS缓冲液洗3次，5min/次，以下步骤避光操作; (10)分别滴加荧光标记二抗，37℃孵育切片30min; (11)PBS缓冲液洗3次，5min/次; (12)滴加DAPI复染细胞核，室温孵育切片10min; (13)PBS缓冲液洗3次，5min/次; (14)50％甘油/PBS封片; (15)在荧光显微镜下观察并采图。 (16)用等量0.01mol/LPBS代替一抗作为阴性对照。高倍视野下(×400)观察，细胞膜出现明亮的红色荧光信号视为ABCG2阳性细胞。 4、制备小鼠气管上皮损伤模型: (1)取昆明小鼠45只，随机分3组，正常组15只，24h和48h组各15只; (2)向每只小鼠腹腔注射致死量水合氯醛1ml/只; (3)取出气管，放入无菌小瓶中，用PBS反复冲洗; (4)正常组气管用眼科剪剪开，灌入中性蛋白酶，37℃孵育2.5h; (5)取出气管，灌入培养基，终止消化，将含有细胞的培养基转移至离心管中，1500rpm离心5min; (6)用PBS洗细胞，转移至EP管中，同样方法离心，弃上清，加入1mlTrizol，-70℃冰箱保存，用于提取RNA; (7)其余气管放入含有5-Fu的培养基中，打击12h; (8)取出气管，放入无菌小瓶中，用PBS反复冲洗，放入培养基中培养，分别在24h和48h后取出; (9)将各时间点气管用眼科剪剪开，灌入中性蛋白酶，37℃孵育2.5h; (10)取出气管，灌入培养基，终止消化，将含有细胞的培养基转移至离心管中，1500rpm离心5min; (11)用PBS洗细胞，转移至EP管中，同样方法离心，弃上清，加入1mlTrizol，-70℃冰箱保存，用于提取RNA。 5、制备小鼠上皮细胞RNA: (1)每个细胞样品，用枪反复吹打使细胞充分裂解，室温孵育5min; (2)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置样品5min; (3)4℃下12000g离心15min，溶液分层; (4)小心吸取上层水相，不超过400μl，转移至新EP管; (5)加入500μl异丙醇，室温孵育10min，用于沉淀RNA; (6)4℃下12000g离心10min，于管底处可见RNA沉淀; (7)弃上清，加入75％乙醇1ml洗涤RNA沉淀，振荡混匀后，4℃下7500g离心5min; (8)弃上清，在空气里干燥10min; (9)用RNAse-Free水溶解RNA，反复吹打使RNA充分溶解，60℃孵育10min，-70℃保存。 6、基于实时定量PCR的基因芯片分析: (1)用紫外分光光度计测定样品RNA的OD260和OD280值，用OD260/280检测RNA纯度，均在1.7-2.1之间; (2)对样品RNA进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性; (3)逆转录反应体系包括MgCl2、10×RTbuffer、RNAse-FreeddH2O、dNTP、RNAse抑制剂、逆转录酶AMV、OligodT，以及样品RNA，用于制备cDNA模板; (4)向实时定量PCR反应混合液中分别加入cDNA模板并混匀，在含有基因特异性引物的96孔板中加入等量的含有模板的反应混合液，进行实时定量PCR反应; (5)利用软件得到芯片中每个基因的Ct值，采用△△Ct方法比较每个基因表达的动态变化; (6)最后利用Darid和Geneontologg数据库，对表达差异≥2或≤0.5的基因进行功能归类。 实验结果 1、5-Fu诱导损伤修复过程中气管上皮的形态学改变: 5-Fu损伤和损伤后修复过程:5-Fu打击后，气管上皮细胞绝大部分脱落，暴露出基底膜，仅剩余少数比较分散的间隔分布的近于裸核的细胞，呈钉状位于基底膜上（即G0期细胞）。5-Fu打击后，恢复12h，裸核样细胞消失，基底膜上可见少量扁平细胞，核大深染，细胞浆有延伸趋势;恢复24h后，基底膜上细胞数量增加，细胞变扁平，并逐渐分化呈立方状;恢复至48h，上皮出现分化，上皮细胞数更多，连接成片，可见到纤毛及clara细胞增加，气管上皮接近恢复假复层纤毛柱状上皮。 2、免疫荧光染色结果: DAPI复染细胞核呈蓝色，细胞膜呈红色荧光为ABCG2阳性表达。5-Fu打击后，基底膜上残留着间隔分布的ABCG2阳性细胞（即G0期细胞）;去除5-Fu后12h，上皮细胞数量逐渐增多，含有较多的ABCG2阳性细胞;恢复至24h，ABCG2阳性细胞数量明显减少;恢复48h，ABCG2阳性细胞减少或消失。 3、5-Fu诱导损伤修复过程中气管上皮细胞的基因芯片解析: N、24h、48h分别为正常气管和经5-Fu打击12h后，继续培养24h、48h小鼠气管上皮的干细胞基因表达芯片结果。可见扩增曲线指数期明显，整体平行性比较好，各反应管扩增效率相近，有较好的重复性和准确性，结果的可信度较高。而且低浓度样本扩增曲线指数期也很明显。曲线与曲线间平行性非常好，基本不会出现假阳性或假阴性的误判。比较N、24h和48h扩增曲线（图2），我们可以看到一些基因的Ct值有改变，即这些基因的表达水平发生了变化，具体有哪些基因在不同时间点上调或下调，我们进一步作了比较分析。本研究使用的是包括84个基因的小鼠干细胞cDNA芯片，测定了多种基因序列并筛选出与正常气管上皮相比表达存在差异的基因。采用96孔板SYBRGreenⅠ染料法，每个孔里含有目的基因的上、下游特异性引物，用于对相同的模板进行同时扩增，检测其在不同时间点达水平的变化。我们利用软件分析了每个干细胞基因在24h和48h与正常气管之间，以及48h与24h之间基因表达水平的比值，反映了不同时间点之间干细胞基因表达的差异。我们发现，24h时检测出39个差异表达基因，其中8个基因表达显著上调，31个基因表达显著下调，而48h时，与正常气管上皮的基因表达情况相比，5个基因表达上调，42个基因表达下调。48h与24h时相比，6个基因表达显著上调，19个基因表达显著下调，基因表达差异用3D直方图表示。 结论 1、我们建立的5-Fu诱导的小鼠气管损伤修复模型，证实气管上皮损伤后残留的G0期细胞中含有气管干细胞，即ABCG2阳性细胞。 2、小鼠气管干细胞分化过程，差异表达基因主要集中在细胞周期调控、细胞连接、FGF、Bmp分子及Notch、Wnt信号通路上。 3、大量Wnt通路成员参与小鼠气管上皮稳态维持，在调控干细胞增殖分化，上皮再生修复中起重要作用 4、大量Notch信号通路成员参与小鼠气管上皮稳态维持，在调控干细胞增殖分化，上皮再生修复中起重要作用 5、气管干细胞分化过程中，新发现Bmp2上调，Bmp1、Bmp3下调，Fgf1上调，而Fgf2下调，提示不同类型基因其生理作用不同，有必要进一步研究。 6、小鼠气管干细胞分化的不同时间段，基因表达有前后顺序。