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在神经退行性疾病,例如脊髓肌肉萎缩(Spinal Muscular Atrophy,SMA)及肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)中,运动神经元(MotorNeurons,MNs)的大量死亡引起了肌肉去神经支配和去神经支配导致的肌肉萎缩。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)诱导的运动神经元可以作为一种替换方式用于这些神经退行性疾病的治疗。
有效的运动控制依赖于运动神经亚型和靶肌肉间精确的连接。由于运动神经元不同亚型在定位,轴突投射及靶标选择方面不同,运动神经亚型的获得是建立正确的连接模式的关键因素。
之前的研究发现,胚胎干细胞在特定的诱导条件下可以产生区域性的运动神经元,具有特异的轴突投射及靶标选择,例如,小鼠胚胎干细胞在视黄酸(Retinoicacid,RA)/Shh诱导条件下呈现颈丛前端,正中运动柱(Median Motor Column,MMC)神经元特征。为了获得上臂投射的运动神经元亚型,我们在胚胎干细胞中转染了上臂外侧运动柱(Lateral Motor Columns,LMC)神经元发育必需的Hoxc6基因。在表达载体中,Hoxc6由3.6kb的HB9基因增强子和Hsp68基础启动子启动表达。转染了Hoxc6基因的胚胎干细胞在DFK10培养基中悬浮培养两天,然后在添加了RA/Shh的DFK10培养基中继续培养5天,其后将悬浮的拟胚体球铺在盖玻片上,添加神经胶质源神经营养因子(Glial-derived neurotrophicfactor,GDNF),脑源神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)继续培养4天,最后利用HB9,tubulin,Hoxc8等抗体对分化后的细胞进行免疫荧光鉴定。在我们的诱导体系下,通过检测HB9和tubulin,发现运动神经元可以有效地产生。全细胞膜片钳检测发现这些运动神经元能够产生重复的动作电位,具有正常的电生理活性。更重要的是,其中一些运动神经元显著表达上臂运动柱神经元的标记Hoxc6和Islet1。我们的结果表明,在有丝分裂后运动神经元中过表达Hoxc6可以充分地改变Hox表达模式,帮助诱导的运动神经元获得上臂外侧运动柱(LMC)神经元特征。体外诱导上臂LMC神经元产生对于运动神经元的基础发育研究和干细胞在神经退行性疾病治疗中的应用研究都有非常重要的意义。