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糖尿病肾病(DN)是终末期肾病的主要原因，它也是糖尿病患者死亡的独立危险因素。DN的发生和发展涉及炎症，代谢，氧化应激与血液动力学因素等多种复杂的病理生理机制。目前，临床上对DN缺乏有效治疗手段。最近动物实验研究发现，已经用于临床辅助降糖药的GLP-1类药物具有一定的肾脏保护作用，但其机制尚未完全明了。对GLP-1肾脏保护作用的机制进行全面深入研究将为GLP-1是否可用于糖尿病肾病的治疗提供依据。 目的: 本实验利用糖尿病肾病大鼠模型，以及体外培养的肾小管微血管内皮细胞和肾小管上皮细胞，研究rhGLP-1对糖尿病肾病的治疗作用，及rhGLP-1对肾小球和肾小管的保护作用及机制，为阐明rhGLP-1的肾脏保护机制和治疗糖尿病肾病的临床应用奠定基础。 方法: 模型及分组:将STZ造模的糖尿病大鼠模型饲养8周后，腹腔埋入含rhGLP-1的微渗泵进行治疗。该微渗泵可以恒定速率连续释放药物。设立含0.9％生理盐水微渗泵的载体治疗组、胰岛素治疗组及正常对照组。各组大鼠共治疗8周。 疗效评价:通过ELISA检测动物血糖、血清C肽、尿蛋白、尿白蛋白水平等临床指标评价rhGLP-1对DN的疗效。并进一步通过检测肾脏光镜和电镜下形态学改变，real-time PCR和Western blot检测肾小球滤过膜裂隙蛋白、细胞外基质的表达。 机制分析:通过免疫荧光双染技术，检测rhGLP-1对胰岛β细胞数量的影响;在肾脏组织切片上采用免疫组化染色检测rhGLP-1对GLP-1R表达的影响以分析rhGLP-1对肾脏是直接作用还是间接作用。然后分别从肾小球和肾小管两方面进行机制研究: 培养大鼠肾小球微血管内皮细胞(RGECs)，利用培养基添加晚期糖基化终末产物(AGEs)模拟糖尿病环境。分别设立正常培养组、AGEs组、rhGLP-1组和胰岛素组。另外分离上述各组大鼠肾小球，分别检测肾小球和RGECs上氧化应激分子一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的水平，并采用real-time PCR、Western blot和免疫组化检测肾小球和RGEC上rhGLP-1对iNOS、SOD表达的影响。进一步检测rhGLP-1对蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)的影响，并使用PKA和PKC信号通路的阻断剂和激动剂分析两条信号通路对NO和ROS的影响。 同上培养和分组处理人肾小管上皮细胞系(HK-2)，利用FITC标记的白蛋白分析HK-2细胞的重吸收功能。在HK-2和分离的肾小管组织上，从mRNA和蛋白水平检测rhGLP-1对重吸收相关受体Megalin和cubilin的影响，以及对PKA和PKC的影响。进一步使用信号通路激动剂和阻断剂分析rhGLP-1对Megalin和Cubulin表达及白蛋白重吸收的影响。 结果: rhGLP-1明显降低了糖尿病大鼠尿白蛋白和尿蛋白，轻度升高了大鼠血液中C肽的水平，但对血糖的影响无明显统计学意义。光镜下，rhGLP-1治疗减轻肾小球硬化;电镜下可见rhGLP-1减轻肾小球足细胞损伤和降低基底膜厚度;分子水平发现rhGLP-1增加裂隙蛋白的表达，降低基底膜基质纤连蛋白的表达。提示rhGLP-1对DN具有治疗作用。 rhGLP-1对血糖降低不明显，也未明显增加胰岛β细胞的数量，但明显上调GLP-1R在肾小球和肾小管的表达，说明rhGLP-1的疗效不依赖于血糖控制，可能直接既作用于肾小球也作用于肾小管。在肾小球组织和RGEC上发现，rhGLP-1下调PKC的表达，增加PKA的表达，同时抑制iNOS减少NO，增加SOD-1的表达降低ROS。给予PKC抑制剂和PKA激动剂可模拟rhGLP-1的作用，而PKC激动剂和PKA阻断剂可阻断rhGLP-1的作用，提示rhGLP-1通过PKC和PKA通路抑制肾小球的氧化应激。 在肾小管上，rhGLP-1增加了白蛋白重吸收相关受体megalin和cubilin的表达，促进HK-2细胞对白蛋白的重吸收。而给予PKC抑制剂和PKA激动剂起到相似效果。给予PKC激动剂和PKA抑制剂拮抗GLP-1的作用。 结论: rhGLP-1对糖尿病肾病的治疗作用不依赖于血糖控制，是对肾脏的直接保护作用。其机制是抑制PKC和激活PKA从而减轻肾小球氧化应激，改善滤过功能，增强肾小管重吸收。