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白藜芦醇以游离态和糖苷结合态两种形式存在,是一种重要的植物抗毒素,主要存在于虎杖、葡萄等植物中。β-葡萄糖苷酶不仅能够水解白藜芦醇苷为白藜芦醇,还能够作用于细胞壁碎片或其它细胞组成,从而生成更多的白藜芦醇。本实验实现了木醋杆菌β-葡萄糖苷酶基因的原核表达,目的是为了生产粗酶制剂,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率;分别在DNA和eDNA水平从黑曲霉中克隆β-葡萄糖苷酶基因,为下一步在酿酒酵母中实现分泌表达以提高葡萄酒的白藜芦醇含量的研究奠定基础。
本实验通过降落PCR得到β-葡萄糖苷酶基因,然后将目的基因亚克隆到原核表达载体pQE30,转化大肠杆菌M15。测序表明,表达载体构建成功。用IPTG诱导表达,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的23.8%,但表达的蛋白主要以包涵体形式存在。
本实验利用种属相似性设计了一对引物。先后以黑曲霉基因组DNA、mRNA为模板,利用PCR与RT-PCR技术得到β-葡萄糖苷酶基因的DNA序列和cDNA序列,将目的基因分别克隆在pMDl8—T和pMDl9—T上。测序表明,克隆得到的DNA序列全长2924 bD,cDNA序列全长2583 bp,编码860个氨基酸。与Genbank中已登录的黑曲霉β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列比较,相似性达97%—99%。