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一研究背景与目的癌症具有较高的发病率和死亡率,严重危害着人类的健康和生命。每年全世界约有700万人死于癌症,并且近几年癌症的死亡率呈明显的上升趋势。化疗是治疗肿瘤的主要手段之一,因此,寻找和开发高效低毒的抗肿瘤药物仍然是攻克肿瘤的主要途径。近年来,根据正常细胞与肿瘤细胞基因表达的不同,有目的地针对肿瘤特异性癌基因的靶向治疗已取得一定的进展,但是由于基因的不稳定性和耐药性问题,基因靶向治疗仍然面临很大的挑战。因此,针对肿瘤发生和发展的原因,寻找新的肿瘤治疗靶点已成为抗肿瘤药物研究开发的重点。近年来,针对肿瘤细胞特异生化环境的改变成为抗肿瘤药物研究的新靶点。活性氧(ROS)是一类化学性质活泼的含氧功能基团物质的统称。它包括过氧化氢(H202)、羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2·)、单线态氧、臭氧(03)、氮氧化物(NOx)、次氯酸(HClO)等。在生理条件下ROS的产生对于细胞的生长是必需的,生理条件下的ROS可以调控细胞的增殖和分化,但是异常升高的ROS则可以促进肿瘤形成。由于肿瘤细胞长期处于ROS高水平的状态,肿瘤细胞的氧化还原体系相对正常细胞更为脆弱,对ROS的调控能力更低,当用ROS诱导剂诱导ROS升高可以选择性的杀死癌细胞而对正常细胞没有影响。细胞的氧化还原体系被认为是抗肿瘤药物研究的新靶点。随着陆地药用生物资源开发范围的日益缩小,人们纷纷将目光投向海洋。海洋生物因生存环境的特殊性(高压、低氧、高盐等),往往含有大量结构新颖奇特、生理活性显著的代谢产物。因此,从海洋中寻求高效低毒的天然药物已引起国际上越来越浓厚的兴趣。Hirsutanol A是从南海珊瑚Sarcophyton tortuosum的内生菌Chondrostereum sp中分离得到的一个倍半萜类化合物,该化合物是从一个新的菌种中分离得到,且该化合物的化学结构仅报道过一次,药理活性未见报道。本研究对从海洋内生菌中分离出来的六个单体化合物进行细胞毒作用的筛选,发现一个倍半萜类化合物Hirsutanol A具有较强的细胞毒作用,于是我们对其抗肿瘤作用及其机制分别从体内和体外进行探讨。二研究方法MTT试验筛选具有抗肿瘤活性的化合物及检测Hirsutanol A对不同肿瘤细胞株的生长抑制作用。DHE. CM-H2DCF-DA染色流式细胞术检测ROS的超氧阴离子和过氧化氢的水平。AnnexinV/PI双染流式细胞术检测Hirsutanol A诱导肿瘤细胞的凋亡率。GFP-LC3转染细胞激光共聚焦检测细胞自噬。免疫印迹方法(Western Blot)检测JNK和Akt信号通路变化,凋亡相关蛋白caspase-3、PARP断裂带和自噬相关蛋白LC3Ⅰ-Ⅱ的转变。Akt激酶活性分析试剂盒检测Hirsutanol A对Akt活性的影响。用线粒体分离试剂盒将线粒体和胞浆分离,免疫印迹方法检测线粒体和胞浆中细胞色素C的表达。应用强抗氧化剂NAC检测ROS抑制对Hirsutanol A诱导的细胞增殖抑制和凋亡以及JNK,Akt磷酸化水平的影响。应用特异性小分子抑制剂SP600125和siRNA瞬时转染方法检测JNK信号通路抑制对于Hirsutanol A诱导的凋亡和ROS水平的影响。应用小分子抑制剂3-MA、Bafilomycin Al及siRNA瞬时转染方法抑制自噬,检测自噬在Hirsutanol A诱导的细胞死亡中的作用。用稳定转染的方法构建Hep3B/myr-Aktl, Hep3B-vector细胞株,MTT法检测Hirsutanol A对Hep3B/myr-Aktl, Hep3B-vector的生长抑制作用。裸鼠成瘤实验观察HirsutanolA对SW620裸鼠移植瘤生长的抑制作用。三研究结果1活性化合物的筛选及Hirsutanol A对不同肿瘤细胞株的细胞毒作用我们对6种化合物进行了筛选,发现Hirsutanol A对多种肿瘤细胞均具有明显的细胞毒作用,并呈现明显的时间-剂量效应关系。2 Hirsutanol A抗肿瘤作用分子机理(1) Hirsutanol A对肿瘤细胞ROS水平的影响我们分别用DHE和CM-H2DCF-DA染色检测Hirsutanol A对肿瘤细胞超氧阴离子和过氧化氢水平的影响,结果显示Hirsutanol A对超氧阴离子水平没影响但能显著增加肿瘤细胞过氧化氢水平,并呈现明显的时间-剂量效应关系。(2) Hirsutanol A上调ROS诱导肿瘤细胞发生凋亡①Hirsutanol A诱导SW620、MDA-MB-231、MCF-7肿瘤细胞发生凋亡AnnexinV/PI双染色法检测Hirsutanol A诱导S W620、MDA-MB-231、MCF-7细胞发生凋亡的情况。结果显示Hirsutanol A能明显诱导SW620、MDA-MB-231、MCF-7细胞发生凋亡,其凋亡率分别为：SW620(2.8%、12.1%、45.0%、65.6%)、MDA-MB-231 (2.6%、10%、22.7%、30.6%)、MCF-7 (1.7%、10%、20、8%、31.3%)且呈明显的剂量依赖关系；Western blot法检测caspase-3、PARP的剪切片段,在17KD和85KD可见明显的断裂带。以上结果表明Hirsutanol A能诱导SW620、MDA-MB-231、MCF-7细胞发生凋亡。②Hirsutanol A通过线粒体途径诱导凋亡为了探讨Hirsutanol A能否通过线粒体途径诱导凋亡,我们分别检测了SW620、MDA-MB-231细胞线粒体膜电位改变以及线粒体和胞浆中细胞色素C的表达。结果显示：SW620、MDA-MB-231细胞线粒体膜电位均呈浓度依赖性升高。用Hirsutanol A处理细胞24h后,线粒体中细胞色素C的表达量明显减少而胞浆中细胞色素C的表达量明显增多。以上结果表明Hirsutanol A通过线粒体途径诱导凋亡。③Hirsutanol A诱导凋亡的发生与ROS相关我们在前面的研究中发现Hirsutanol A对多种肿瘤细胞均有增殖抑制作用,而且可以显著上调SW620、MDA-MB-231、MCF-7细胞的ROS水平,为了证明Hirsutanol A通过上调ROS而发挥抗肿瘤的作用。我们用强抗氧化剂NAC抑制Hirsutanol A对ROS的上调作用后,检测Hirsutanol A对细胞的增殖抑制作用和细胞凋亡的影响。结果显示NAC可明显减少Hirsutanol A诱导的增殖抑制作用和Hirsutanol A诱导的细胞凋亡。④Hirsutanol A通过上调ROS激活JNK通路研究发现ROS可以调控JNK、Akt、NF-κB等多条信号通路,接下来我们进一步探讨Hirsutanol A激活ROS后对JNK通路的影响。用HirsutanolA处理SW620细胞24 h, Western blot检测JNK和c-Jun蛋白磷酸化水平,可见JNK和c-Jun蛋白磷酸化水平明显升高。用ROS抑制剂NAC预处理细胞后,NAC可以抑制Hirsutanol A对JNK的激活作用。说明Hirsutanol A激活JNK通路的作用与ROS上调相关。⑤JNK通路激活的作用用JNK抑制剂SP600125抑制JNK通路后,分别用MTT检测细胞的活性和AnnexinV/PI双染色法检测细胞的凋亡,可见SP600125可明显增加Hirsutanol A诱导的细胞死亡；单用Hirsutanol A细胞的凋亡率为35.6%,用SP600125阻断JNK通路后,Hirsutanol A诱导的细胞凋亡率上升到48.3%,阻断JNK通路可以增加Hirsutanol A诱导的细胞凋亡。表明JNK通路的激活不仅不能诱导细胞发生凋亡,还能保护细胞免受死亡。接下来我们进一步探讨了JNK通路激活对ROS的调控作用,用JNK抑制剂SP600125预处理细胞或siRNA阻断JNK通路后,流式细胞仪检测ROS的水平,结果显示阻断JNK通路能显著增加Hirsutanol A诱导的ROS水平。说明JNK通路的激活并不诱导细胞凋亡而是负反馈的调控ROS水平,是细胞的一种氧化应激保护机制。(3) Hirsutanol A上调ROS诱导肿瘤细胞发生自噬①Hirsutanol A通过上调ROS诱导肿瘤细胞发生自噬LC3可作为自噬体膜标志性蛋白,我们先用与绿色荧光蛋白(GFP)结合的GFP-LC3来检测自噬,将Hep3B转染GFP-LC3质粒24 h后,用20μmol/L HirsutanolA处理24h,于激光共聚焦显微镜下观察,可见Hirsutanol A处理组出现大量LC3点状聚集,而对照组LC3呈弥散分布。接下来我们进一步用Western blot检测LC3蛋白表达,可见LC3由Ⅰ型向Ⅱ型转化增加,提示Hirsutanol A可以诱导肿瘤细胞发生自噬。Hirsutanol A能够上调ROS水平和诱导自噬,接下来我们进一步探讨HirsutanolA上调ROS水平和诱导自噬之间的相关性。分别用Western blot检测LC3蛋白表达和激光共聚焦检测LC3点状聚集,结果显示加入NAC预处理细胞后,Hirsutanol A诱导的LC3由Ⅰ型向Ⅱ型转化明显减少,LC3点状聚集亦明显减少。以上结果表明Hirsutanol A通过上调ROS诱导肿瘤细胞发生自噬。②Hirsutanol A通过上调ROS抑制Akt通路Akt/mTOR是调控自噬的一条主要通路,我们在前面的研究中发现HirsutanolA可以诱导肿瘤细胞产生ROS,并诱导肿瘤细胞发生自噬。于是我们进一步探讨Hirsutanol A对Akt通路的影响。用Hirsutanol A处理细胞24 h后,Western blot检测Akt、P-Akt473和P-FKHR蛋白表达水平,发现Akt表达水平不变但P-Akt473和P-FKHR表达水平明显降低,说明Hirsutanol A可以抑制Akt通路。接下来我们进一步探讨Hirsutanol A对Akt通路抑制作用与ROS上调的相关性,先用Akt激酶活性分析法检测Hirsutanol A在体外对Akt激酶活性的影响,结果显示Hirsutanol A在体外不能直接抑制Akt激酶的活性。用NAC预处理Hep3B细胞1h然后加入Hirsutanol A处理24 h, Western blot检测P-Akt473蛋白表达水平,可见NAC可部分逆转P-Akt473的表达水平。说明AKT通路抑制与ROS上调相关。③Hirsutanol A诱导Hep3B细胞发生非凋亡性死亡我们用AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡时发现,用5、10、20μmol/L HirsutanolA处理Hep3B细胞48 h后,AnnexinV单阳性率最高仅为0.5%,而PI阳性率分别为5.5%、15.9%、49.7%。Western blot检测Caspase-3, PARP表达,结果显示在17KD和85KD均未见明显的断裂带。该结果表明Hirsutanol A诱导Hep3B细胞发生非凋亡性死亡。④Hirsutanol A诱导Hep3B细胞发生自噬性死亡为了证明Hirsutanol A诱导Hep3B细胞发生自噬性死亡,我们分别用自噬抑制剂3-MA和siRNA-Beclinl阻断自噬。MTT法检测阻断自噬后Hirsutanol A对细胞生长抑制和死亡的影响。结果显示,阻断自噬可以明显降低Hirsutanol A诱导的细胞死亡。⑤Hirsutanol A诱导Hep3B细胞自噬性死亡与ROS上调和Akt通路抑制相关为了验证Hirsutanol A诱导Hep3B细胞自噬性死亡与ROS上调的关系,我们用1mmol/L的NAC预处理细胞1h,然后加入Hirsutanol A处理72 h,分别用MTT法和AnnexinV/PI双染法检测细胞增殖抑制和死亡情况,结果显示NAC可明显减少Hirsutanol A诱导的细胞增殖抑制和死亡。我们还构建了Hep3B/myr-Aktl, Hep3B-vector细胞株,检测Hirsutanol A诱导的细胞死亡与Akt通路之间的关系,结果显示Hirsutanol A对Hep3B/myr-Akt1细胞的生长抑制作用明显高于Hep3B-vector细胞。说明Hirsutanol A诱导Hep3B细胞自噬性死亡与ROS上调和Akt通路抑制相关。⑥抑制自噬可以促进Hirsutanol A诱导的MCF-7细胞死亡我们在研究中发现Hirsutanol A既可以诱导肿瘤细胞MCF-7发生凋亡也可以诱导发生自噬,那么Hirsutanol A诱导的自噬是起到保护作用还是促进细胞死亡的作用呢?我们分别用自噬抑制剂Bafilomycin Al和siRNA-Atg-7抑制自噬,MTT法检测细胞的死亡。结果显示,阻断自噬可以明显的增加细胞的死亡,说明Hirsutanol A诱导的自噬在MCF-7细胞中起保护细胞免受死亡的作用。3 Hirsutanol A对裸鼠移植瘤的抑制作用20 mg／kg剂量的Hirsutanol A能明显抑制裸鼠移植瘤的生长,抑瘤率31.5%而5 mg／kg的治疗剂量对瘤组织体积的增长无明显抑制作用。四结论1 Hirsutanol A通过上调ROS,引起线粒体损伤,细胞色素C释放从而诱导肿瘤细胞SW620、MDA-MB-231发生凋亡。2 Hirsutanol A通过上调ROS，抑制Akt通路诱导肿瘤细胞Hep3B发生自噬性死亡。3 Hirsutanol A既可诱导肿瘤细胞MCF-7发生凋亡也可诱导其发生自噬,自噬在MCF-7细胞中起到保护作用。4 Hirsutanol A通过上调ROS水平激活JNK通路,JNK通路激活并不诱导凋亡而是负反馈调控ROS水平。5 Hirsutanol A明显抑制裸鼠结肠癌SW620移植瘤的生长。