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米色脂肪是一种类似棕色脂肪的新型脂肪，能够在适当刺激下以非颤栗性产热的形式消耗能量，因此白色脂肪米色化作为潜在的预防及治疗肥胖的新型作用靶点，日益受到关注。n-3多不饱和脂肪酸（n-3PUFA）作为功能性脂肪酸，在生长发育、稳定细胞膜功能、免疫调节和抗炎等方面具有有益的作用。但是对于n-3PUFA在脂肪细胞代谢的组学解析和其对白色脂肪米色化的调控作用知之甚少。本文以3T3-L1细胞为研究模型，从细胞代谢组学和分子水平的角度，探究了n-3PUFA代表性单体二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）对于脂肪细胞代谢组水平的影响以及调控米色化过程的分子机制，探究其作为一种过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）激动剂促进米色化过程的可能性，详细研究内容和结果如下：
1、EPA和DHA对于3T3-L1前脂肪和成熟脂肪细胞代谢组的调控研究
采用MTT比色法确定10μM和100μM作为EPA和DHA的干预浓度。收集细胞内容物和上清液中的代谢物，利用UHPLC-Q-Exactive-HRMS高分辨质谱和统计学模型，筛选出正负离子模式下潜在代谢差异物，与人类代谢组数据库（HMDB）和MZcloud数据库进行比对，分析其可能影响的代谢通路，探究代谢物变化。EPA和DHA干预前脂肪细胞48h后，细胞内外的代谢物和代谢水平均没有显著变化；EPA和DHA干预成熟脂肪细胞24h后显著上调了与三羧酸循环（TCA）相关的琥珀酸含量，并在负离子模式中发现2种未知代谢物，其含量与干预n-3PUFA种类和剂量呈显著相关性，与对应n-3PUFA质量数的差值相近（小于5ppm），结构与对应n-3PUFA具有相关性。
2、EPA和DHA对于3T3-L1细胞分化阶段代谢组的调控研究
采用MTT比色法确定10μM和100μM作为EPA和DHA的干预浓度。采用上述所建立的细胞代谢组学分析策略，进一步探究其对脂肪分化发育过程中代谢组的影响。相较前脂肪和成熟脂肪细胞，这一阶段所获得的代谢物种类最多；在脂肪细胞分化过程中，EPA显著影响了TCA循环和甘油磷脂代谢相关的代谢物，DHA显著影响了甘油磷脂代谢相关的代谢物水平，可能诱导了米色脂肪表型的形成；在负离子模式中新发现4种未知代谢物（其中两种与上文发现的相同），其浓度与干预的n-3PUFA种类和剂量呈显著相关性，新的2种未知物与对应n-3PUFA质量数的差值也相近（小于5ppm），结构与对应n-3PUFA具有相关性。
3、EPA和DHA对促进白色脂肪米色化表型和基因表达的影响
考虑到相比前脂肪和成熟脂肪中代谢组学结果，分化中干预对于细胞能量代谢和脂质代谢水平有显著影响，因此选用在分化过程中干预进一步探究对米色化过程的影响。相较于对照组，10μM和100μM的EPA和DHA在分化过程中干预显著增加了细胞的葡萄糖消耗量（p均小于0.001），而10μM和100μM的DHA还显著降低了细胞内37%和40%甘油三酯的含量（p均小于0.05）。EPA和DHA显著促进了线粒体亚蛋白琥珀酸脱氢酶复合体A亚基（SdhA）和ATP合成酶5A1（ATP5A1）的表达，从而增强了线粒体能量代谢。DHA和EPA显著上调了细胞内解偶联蛋白1（UCP1）基因和米色化标志性基因CD40、CD137和CITED1的mRNA表达水平；高剂量的DHA和EPA显著促进UCP1和CD137蛋白的表达水平，诱导了米色脂肪细胞表型的形成。
4、EPA和DHA调控脂肪米色化过程的分子机制
进一步探究n-3PUFA对于基于PPARγ和PRDM16的米色脂肪发育调控通路的影响，结果表明100μM的DHA和EPA显著上调PPARγ和PR域锌指蛋白16（PRDM16）的蛋白表达水平，降低PPARγ乙酰化修饰和PRDM16泛素化修饰水平从而增强其生物活性；10μM和100μM的EPA和DHA均可以对PRDM16蛋白的合成起到稳定作用，但100μM的EPA更有效。进一步试验发现，n-3PUFA干预对PRDM16敲除的脂肪细胞中UCP1和CD137蛋白表达无显著影响。为全面探究n-3PUFA对于米色脂肪中miRNAs的影响，选用100μM EPA干预的miRNAs芯片结果表明，EPA显著下调了与米色脂肪发育调控相关的miR-378a、miR-34a，显著上调了miR-26a的表达水平；此外还显著上调了miR-362和miR-486a/b的表达。进一步qPCR结果表明100μM的EPA和DHA均显著性降低了miR-378a和miR-34a的表达水平。
本文结合了多种分析技术，从细胞代谢组学和分子生物学的角度综合地解析了EPA和DHA对3T3-L1细胞代谢组的时空调控和其对米色化过程调控的分子机制。细胞代谢组学的结果为后续米色化调控研究提供了指引方向，从而进一步分析发现EPA和DHA通过上调PPARγ和PRDM16蛋白水平的表达，上调UCP1和米色化标志性基因（CD40、CD137和CITED1）表达等促进了米色化过程。相关研究完善了n-3PUFA在脂肪细胞代谢组学时空调控机制的研究结果，加深n-3PUFA调控脂肪米色化过程的分子机制的科学认识，并为其作为一种PPARγ激动剂促进米色脂肪产生，成为肥胖的潜在预防和治疗靶点提供了科学依据。
1、EPA和DHA对于3T3-L1前脂肪和成熟脂肪细胞代谢组的调控研究
采用MTT比色法确定10μM和100μM作为EPA和DHA的干预浓度。收集细胞内容物和上清液中的代谢物，利用UHPLC-Q-Exactive-HRMS高分辨质谱和统计学模型，筛选出正负离子模式下潜在代谢差异物，与人类代谢组数据库（HMDB）和MZcloud数据库进行比对，分析其可能影响的代谢通路，探究代谢物变化。EPA和DHA干预前脂肪细胞48h后，细胞内外的代谢物和代谢水平均没有显著变化；EPA和DHA干预成熟脂肪细胞24h后显著上调了与三羧酸循环（TCA）相关的琥珀酸含量，并在负离子模式中发现2种未知代谢物，其含量与干预n-3PUFA种类和剂量呈显著相关性，与对应n-3PUFA质量数的差值相近（小于5ppm），结构与对应n-3PUFA具有相关性。
2、EPA和DHA对于3T3-L1细胞分化阶段代谢组的调控研究
采用MTT比色法确定10μM和100μM作为EPA和DHA的干预浓度。采用上述所建立的细胞代谢组学分析策略，进一步探究其对脂肪分化发育过程中代谢组的影响。相较前脂肪和成熟脂肪细胞，这一阶段所获得的代谢物种类最多；在脂肪细胞分化过程中，EPA显著影响了TCA循环和甘油磷脂代谢相关的代谢物，DHA显著影响了甘油磷脂代谢相关的代谢物水平，可能诱导了米色脂肪表型的形成；在负离子模式中新发现4种未知代谢物（其中两种与上文发现的相同），其浓度与干预的n-3PUFA种类和剂量呈显著相关性，新的2种未知物与对应n-3PUFA质量数的差值也相近（小于5ppm），结构与对应n-3PUFA具有相关性。
3、EPA和DHA对促进白色脂肪米色化表型和基因表达的影响
考虑到相比前脂肪和成熟脂肪中代谢组学结果，分化中干预对于细胞能量代谢和脂质代谢水平有显著影响，因此选用在分化过程中干预进一步探究对米色化过程的影响。相较于对照组，10μM和100μM的EPA和DHA在分化过程中干预显著增加了细胞的葡萄糖消耗量（p均小于0.001），而10μM和100μM的DHA还显著降低了细胞内37%和40%甘油三酯的含量（p均小于0.05）。EPA和DHA显著促进了线粒体亚蛋白琥珀酸脱氢酶复合体A亚基（SdhA）和ATP合成酶5A1（ATP5A1）的表达，从而增强了线粒体能量代谢。DHA和EPA显著上调了细胞内解偶联蛋白1（UCP1）基因和米色化标志性基因CD40、CD137和CITED1的mRNA表达水平；高剂量的DHA和EPA显著促进UCP1和CD137蛋白的表达水平，诱导了米色脂肪细胞表型的形成。
4、EPA和DHA调控脂肪米色化过程的分子机制
进一步探究n-3PUFA对于基于PPARγ和PRDM16的米色脂肪发育调控通路的影响，结果表明100μM的DHA和EPA显著上调PPARγ和PR域锌指蛋白16（PRDM16）的蛋白表达水平，降低PPARγ乙酰化修饰和PRDM16泛素化修饰水平从而增强其生物活性；10μM和100μM的EPA和DHA均可以对PRDM16蛋白的合成起到稳定作用，但100μM的EPA更有效。进一步试验发现，n-3PUFA干预对PRDM16敲除的脂肪细胞中UCP1和CD137蛋白表达无显著影响。为全面探究n-3PUFA对于米色脂肪中miRNAs的影响，选用100μM EPA干预的miRNAs芯片结果表明，EPA显著下调了与米色脂肪发育调控相关的miR-378a、miR-34a，显著上调了miR-26a的表达水平；此外还显著上调了miR-362和miR-486a/b的表达。进一步qPCR结果表明100μM的EPA和DHA均显著性降低了miR-378a和miR-34a的表达水平。
本文结合了多种分析技术，从细胞代谢组学和分子生物学的角度综合地解析了EPA和DHA对3T3-L1细胞代谢组的时空调控和其对米色化过程调控的分子机制。细胞代谢组学的结果为后续米色化调控研究提供了指引方向，从而进一步分析发现EPA和DHA通过上调PPARγ和PRDM16蛋白水平的表达，上调UCP1和米色化标志性基因（CD40、CD137和CITED1）表达等促进了米色化过程。相关研究完善了n-3PUFA在脂肪细胞代谢组学时空调控机制的研究结果，加深n-3PUFA调控脂肪米色化过程的分子机制的科学认识，并为其作为一种PPARγ激动剂促进米色脂肪产生，成为肥胖的潜在预防和治疗靶点提供了科学依据。