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目的: 中药雷公藤和附子是在临床上有广泛的应用，但是它们也有很多副作用，包括心脏毒性。为了更早地诊断和防治药物引起的心脏毒性，我们旨在寻找新的雷公藤和附子的早期心脏毒性生物标志物。通过雷公藤和附子动物实验，我们对现有的临床常用的心脏毒性生物标志物进行了检测，发现只有在心肌严重受损时，现有的指标才会出现变化。因此，我们通过雷公藤甲素的亚急性毒性实验，首先筛选出心肌和血液内出现变化的miRNA，然后再用定量PCR的技术验证筛选出的miRNA是否能够作为雷公藤心脏毒性的生物标志物，且探寻这些miRNA表达随时间的变化情况。 方法: 1.分别制备雷公藤和附子的水提物，浓缩为浸膏，使用时以蒸馏水稀释、混匀。体重为120 g～140 g的SD大鼠，雌雄各半，随机各分为3组，每组6只。分别为雷公藤组，附子组，空白组。给药浓度为:雷公藤组[30g生药/kg]、附子组[30g生药/kg]和空白对照组。一次灌胃给药，观察14天后，取血液和脏器，计算脏器比，心脏进行HE染色，观察心肌病理状态，ELISA法检测血浆中心肌肌钙蛋白Ⅰ和颗粒酶B的浓度，然后用试剂盒检测心肌所含有的CK-MB、CAT、LDH、GSH-Px活力和谷胱甘肽单位含量。 2.体重为120 g～140g的SD大鼠，雌雄各半，随机各分为2组，每组8只。分别为雷公藤甲素组、空白组，给药量为1mg/kg，药物以羧甲基纤维素钠CMC-Na溶液混悬，临用前摇匀灌胃。一次灌胃给药，观察14天后，取血液和脏器，计算脏器比，心脏进行HE染色，观察心肌病理状态，ELISA法检测血浆中心肌肌钙蛋白Ⅰ和颗粒酶B的浓度，然后用试剂盒检测脏器内乳酸脱氢酶、肌酸激酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力和谷胱甘肽单位含量。 3.检测雷公藤甲素急毒的血浆、心肌、肝、肾内芳香烃受体的蛋白表达，以及AHR和其下游基因CYP1A1在心肌的基因表达水平。 4.体重为120 g～140 g的SD雄性大鼠，随机分为5组，每组12只，雷公藤甲素以羧甲基纤维素钠CMC-Na溶液混悬，临用前摇匀灌胃，浓度分别为:100μg/kg、50μg/kg、25μg/kg、12.5μg/kg，连续灌胃14天，然后检测各组血浆中心肌肌钙蛋白Ⅰ的含量，取100μg/kg组大鼠的心肌做HE染色切片，观察心肌的损伤程度。并取100μg/kg剂量的雷公藤甲素组大鼠的血浆和心脏进行miRNA-PCR芯片分析。 5.体重为120 g～140g的SD雄性大鼠，随机分为7组，每组6只，雷公藤甲素以羧甲基纤维素钠CMC-Na溶液混悬，临用前摇匀灌胃，给药量为0.1mg/kg，1-7组分别依次为给药0，1，2，3，5，7，14天后解剖，用定量PCR的方法测定血浆和心肌中MicroRNA的表达情况，以验证筛选出的MicroRNA。 结果: 1.雷公藤和附子急性毒性实验后，与对照组相比，雌雄两性大鼠的心脏脏器比均明显增加，说明心脏出现肿胀现象，HE染色结果也表明，给药组的雄性大鼠的心肌损伤比雌性大鼠的更为严重。雷公藤和附子水提取物使雄性大鼠心肌的CK-MB、CAT、LDH和GSH-Px活力显著下降，也使得GSH单位含量明显下调，相反，在雌性大鼠中，这些酶活力反而是上升的。雷公藤和附子水提取物使雄性大鼠cTnⅠ和心肌颗粒酶B的浓度显著上升;雌性大鼠的肌钙蛋白-Ⅰ浓度无变化，颗粒酶B的浓度升高。说明，雷公藤和附子水提取物对雄性大鼠的毒性较雌性大鼠严重，而只有在心肌受到严重损伤时，心肌的CK-MB、LDH、CAT、GSH-PX活力才会下降，而轻微的心脏毒性作用反而使这些酶的活性上调。同样，只有在心肌受到严重损害的时候，大鼠血浆内GZMB和cTnⅠ的检测才是有意义的。且在心肌疾病上，两性存在很大的差异。 2.HE染色表明，雷公藤甲素可引起雄性大鼠心肌细胞间质水肿和细胞核空泡化，雌性大鼠心肌细胞间水肿。而在相同试验剂量下，肝脏和肾脏的HE染色结果并未发现明显变化。雷公藤甲素能增加心脏脏器比、降低心率，它使雄性大鼠的CK-MB、LDH、CAT、GSH-PX活力和GSH的含量均呈显著下降趋势，而雌性大鼠指标均无明显变化;肝脏和肾脏的LDH、CK-BM活力在雌雄两性中的表达也无显著变化，说明此剂量下的雷公藤甲素可引起心脏毒性，而对肝脏和肾脏无明显损伤。雷公藤甲素还能使雄性大鼠血浆内肌钙蛋白Ⅰ呈上升趋势，雌性组无变化;而颗粒酶B的浓度在两性大鼠中均无显著变化。 3.雷公藤甲素使雌雄大鼠心肌和血浆内AHR的表达均下降，而肝脏和肾脏内AHR的表达无明显变化，说明血浆内AHR的来源不是肝、肾而是心脏。且雷公藤甲素使雌雄大鼠心肌内CYP1A1的表达均明显下降。我们认为循环AHR水平可作为雷公藤甲素心脏毒性的一个潜在早期生物标志物。 4.雷公藤甲素亚急性毒性实验后，通过检测发现，与对照组比较，各个给药组的肌钙蛋白Ⅰ的含量均无显著变化。而从100μg/kg组大鼠的心肌HE染色切片可以看出雷公藤甲素组出现了心肌纤维断裂，心肌细胞肥大的现象，说明100μg/kg雷公藤甲素对大鼠的心肌有明显的损伤，而肌钙蛋白Ⅰ的含量却并未出现变化。miRNA-PCR芯片分析结果显示，确定在人体内表达的miR-15a-3p、miR-615、miR-127-5p、miR-483-5p、miR-194-2-3p和miR-452-5p以及尚未确定在人体内表达的miR-691、miR-1898、miR-669e-5p、miR-466h-5p、miR-466c-5p、miR-669a-5p、miR-1894-5p、miR-667-3p和miR-742-3p在心脏或血液中浓度均出现了明显的升高。 5.定量PCR结果表明，miRNA-127-5p和miRNA-615的上升出现在早期，而miR-15a-3p和miR-483-3p的上升则出现在miRNA-127-5p和miRNA-615下降之后。故上述四种miRNA的组合可以为雷公藤性心脏病不同阶段的诊断提供可能的选择。 结论: 本课题中我们进行了雷公藤和附子急毒实验，对临床常用的心肌酶、肌钙蛋白Ⅰ和颗粒酶B进行检测，当心肌损伤严重时这些指标才会改变。通过对血浆和脏器内AHR蛋白和基因水平表达的检测，发现AHR对雷公藤甲素的心脏毒性比现有生物标志物更为敏感，可作为潜在的心脏毒性生物标志物。通过miRNA-PCR芯片我们筛选出一系列对雷公藤甲素心脏毒性敏感的miRNA，并通过定量PCR进行验证，最终得出miRNA-127-5p和miRNA-615的早期上升和miR-15a-3p和miR-483-3p的晚期上升的组合可以为雷公藤性心脏病不同阶段的诊断提供可能的选择。