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第一部分紫绀型先心病VEGF、SDF-1血清水平和循环EPCs数量及功能变化的相关性研究目的:探讨紫绀型先心病VEGF、SDF-1的血清水平和循环EPCs数量及功能变化的关系,在分子、细胞水平,阐明他们之间的联系和作用机制。方法:采用ELISA法检测外周血清SDF-1和VEGF的水平;采用密度梯度离心法和贴壁法分离内皮祖细胞,体外扩增培养;采用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL-DiI)和FITC标记的荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)染色细胞,激光共聚焦显微镜初步鉴定,UEA-1和DiLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs;并用倒置荧光显微镜,对每孔进行计数(计数15个随机选择的×200视野的EPCs)。采用MTT比色法、改良的Boyden小室和粘附能力测定实验,观察EPCs的增殖能力、迁移能力及粘附能力。并用回归分析方法分析VEGF、SDF-1水平与EPCs数量及功能的相关性。结果:紫绀型先心病患者VEGF、SDF-1的血清水平明显高于非紫绀组,两组比较:VEGF(ng/L):201.42±44.74 vs 113.56±35.62,P<0.05;SDF-1(ng/L):3.4535±1.0732 vs 1.05368±0.98692,P<0.05;紫绀型先心病患者内皮祖细胞的数量明显高于非紫绀组,两组比较:5915±1016 vs 3118±717,200倍视野,P<0.05;紫绀型先心病患者内皮祖细胞的功能明显强于非紫绀组,两组比较:1.增殖能力:0.3377±0.0205 vs 0.2657±0.0142,490nm光吸收值,P<0.05;2.迁移能力:146.6±9.24 vs 91.84±8.58,200倍视野的细胞数,P<0.01;3.黏附能力:149±11.58 vs 112.6±7.02,30份钟的贴壁细胞数,P<0.01。紫绀型先心病患者的VEGF、SDF-1的血清水平与EPCs数量及功能变化表现出明显的一致性,其相关系数分别为0.675、0.835、0.724。结论:1.紫绀型先心病外周血中存在着大量EPCs,且数量及功能明显增加,可以作为自体种子细胞的来源之一。2.VEGF、SDF-1的高表达可能促进循环EPCs的数量增加和功能增强。3.紫绀型先心病VEGF、SDF-1血清水平明显增加,且与EPCs数量和功能的变化有明显的相关性,可能共同影响着患者的一些病理、生理变化。第二部分组织细胞中HIF-1a mRNA、蛋白的表达与VEGF、SDF-1血清水平的相关性研究目的:探讨紫绀型先心病心肌组织中HIF-1a mRNA、蛋白的表达,并分析HIF-1a mRNA、蛋白的表达与血清VEGF、SDF-1水平的关系,在基因、蛋白水平,阐明他们之间的内在联系及可能的机制。方法:采用ELISA法检测外周血清SDF-1、VEGF的水平;采用免疫组化方法检测心肌细胞中HIF-1a的蛋白表达,进一步对心肌细胞进行HIF-1a mRNA的提取及RT-PCR实时定量分析和蛋白质的提取及western-blot蛋白的检测,采用回归分析方法,分析HIF-1a mRNA、蛋白的表达与VEGF、SDF-1血清水平表达的关系。结果:紫绀型先心病心肌组织细胞中HIF-1a mRNA、蛋白的表达显著的高于非紫绀型先心病;且与VEGF、SDF-1的血清水平表达一致,其相关系数为0.626。结论:1.缺氧可以引起组织细胞HIF-1a的高表达,HIF-1a的高表达,可以明显提高其靶基因的VEGF、SDF-1的血清水平,促进EPCs数量的增加和功能的增强。2.组织细胞HIF-1a的蛋白水平与VEGF、SDF-1血清水平的变化有明显的相关性,可能共同影响着紫绀型先心病一些病理与生理变化。第三部分HIF-1a在体外对EPCs增殖能力、迁移能力影响的实验研究目的:探讨在体外HIF-1a对EPCs增殖、迁移能力的影响,在基因、蛋白水平,进一步阐明HIF-1a对EPCs影响的可能作用机制,为临床上自体EPCs的应用提供理论依据。方法:密度梯度法分离人外周血EPCs;电穿孔技术转染HIF-1a质粒至EPCs,用倒置荧光显微镜,对各组质粒转染前、后EPCs每孔进行计数(计数15个随机选择的×200视野的EPCs),并观察其形态学的变化;免疫荧光检测转染前、后HIF-1a蛋白的表达;RT—PCR法检测未转染/转染质粒在转染后6h、12h、24h、48h、72h HIF-1a mRNA及下游靶基因VEGF mRNA表达含量的变化,以及在不同组质粒转染后的差异;ELISA法测定各组质粒转染后6h、12h、24h、48h、72h,VEGF在培养基上清中释放含量。采用M3T比色法、改良的Boyden小室测定实验,检测各组质粒转染前、后EPCs的增殖能力和迁移能力。结果:HIF-1a基因可以有效转染入EPCs;HIF-1a mRNA在未转染时即有表达,在HIF-1a质粒转染后6、12、24、48h、72h HIF-1amRNA含量较未转染时均增加,且在12h HIF-1a mRNA含量达到最高;HIF-1a诱导VEGF表达上调,VEGF释放含量在HIF-1a转染组显著增加,VEGF mRNA的含量变化在转染后24h达到高峰。转染HIF-1a质粒至EPCs后,EPCs的增殖能力和迁移能力明显增强。结论:1.HIF-1a在体外明显增强EPCs增殖能力和迁移能力。2.HIF-1a能促进其下游靶基因VEGF的表达。