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目的构建野生型和突变型SMARCAL1慢病毒载体,初步研究Schimke免疫-骨发育不良（SIOD）新发致病突变对SMARCAL1蛋白表达的影响。方法采集一例新确诊SIOD患儿外周血样本进行基因测序,通过检测发现新发突变位点,利用蛋白质分析软件初步预测新发突变蛋白功能。利用PCR技术合成野生型和突变型SMARCAL1基因序列,突变型SMARCAL1基因序列包含新发突变位点。准备载体pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO,通过酶切反应获得线性化载体。设计包含酶切位点的引物,利用PCR扩增技术获得野生型和突变型SMARCAL1基因片段。利用HB-infusionTM无缝克隆试剂盒将线性化载体和目的基因片段进行连接重组,重组质粒产物加入感受态细胞DH5α悬液进行转化,挑取平板单个菌落进行PCR鉴定,选取阳性克隆转化子测序分析。分别对序列正确的野生型重组转化子和突变型重组转化子进行质粒抽提,抽提的质粒与慢病毒包装辅助质粒共同感染293T细胞,转染后48小时和72小时两次收集病毒上清,超速离心纯化,测定病毒滴度后分装保存。传代培养HEK293细胞,通过预实验摸索慢病毒转染HEK293细胞最适Polybrene浓度和最适MOI值。分别用空载型、野生型和突变型慢病毒载体转染HEK293细胞,用适宜浓度的嘌呤霉素连续筛选并传3代,得到三组稳转细胞株。分别提取正常HEK293细胞及空载型、野生型、突变型稳转细胞株的总蛋白,利用Western Blot技术检测四组细胞中SMARCAL1蛋白的表达情况。结果SIOD患儿基因检测发现SMARCAL1基因（NM014140.3）Exon5:c.1071delT;p（Phe357fs）。该突变为移码突变,蛋白质分析软件预测为有害,预计会导致SMARCAL1基因所编码的蛋白质发生截短从而影响其正常生物功能。HGMD数据库未见该突变的相关报道,且ESP6500siv2ALL、千人基因组和dbSNP147等数据库均未见收录。通过分别对野生型和突变型阳性克隆转化子测序,并分析比对野生型和突变型SMARCAL1基因片段序列,证实与野生型、突变型目标区序列一致,提示成功构建野生型和突变型SMARCAL1过表达慢病毒载体。慢病毒转染HEK293细胞48小时后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,提示转染成功。Western Blot结果显示:突变组SMARCAL1蛋白表达水平明显低于野生组、正常组和空载组,P<0.05;提示新发突变造成SMARCAL1蛋白表达减少。结论患儿外周血基因检测发现SMARCAL1新发移码突变,蛋白质分析软件预测该移码突变会导致SMARCAL1基因所编码的蛋白质发生截短从而影响其正常生物功能。成功构建了野生型和突变型SMARCAL1过表达慢病毒载体,用于后续体外细胞实验研究。成功转染HEK293细胞,获得野生型和突变型SMARCAL1稳转细胞株。Western Blot证实SMARCAL1新发突变为SIOD致病突变。