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盐胁迫是影响植物生长和发育的重要的环境因子之一。研究植物对盐胁迫的应答机制不仅对于理解基础分子生物学非常重要,而且还能为提高作物的耐盐性提供有价值的遗传信息。近年来,盐芥(Thellungiella halophila)—一种典型的耐盐植物-以其与拟南芥相似的遗传学特性而成为理想的模式盐生植物。现有的研究暗示盐芥具有独特的耐盐机制,因此分离鉴定盐芥中的耐盐关键基因具有重要的理论和实际应用的价值。
本论文研究利用裂殖酵母系统对盐芥中耐盐相关的基因进行功能性筛选。通过在含有可诱导的nmt1启动子的裂殖酵母表达载体pREP-5N上构建盐芥的cDNA文库,并将其转入裂殖酵母细胞,再对酵母转化子中的盐芥cDNA片段进行诱导表达,一共筛选分离得到52个具有耐盐性的转化子。对这些耐盐转化子中含有的cDNA插入片段进行序列比对,并对其编码的蛋白进行功能分类,结果显示其中有8%属于盐应答/耐盐相关蛋白,4%属于离子/渗透平衡相关蛋白,15%属于抗氧化/解毒相关蛋白,15%属于调控蛋白,10%属于细胞膜/细胞壁蛋白,还有21%属于未知蛋白。这些结果表明裂殖酵母是一个快速有效的适于规模化功能性分离植物耐盐相关基因的系统。
在以上耐盐转化子所含的cDNA中,一个编码单结构域亲环蛋白(cyclophilin)的ThCYP1基因得到了深入的研究。Southern分析表明cyclophilin在盐芥中是一个较小的基因家族而ThCYP1是其中一个单拷贝成员。Northern分析表明ThCYP1的表达受到NaCl、ABA、H2O2和热的诱导,但对寒不敏感。器官特异性分析表明ThCYP1存根、茎、叶和花中呈组成型表达,但在根和花中表达量更高。亚细胞定位分析表明ThCYP1在细胞质和细胞核中均有分布,但主要集中在细胞核中。在烟草BY2细胞中过量表达ThCYP1能显著增强其细胞的耐盐性。这些结果表明ThCYP1可能通过协助胁迫相关蛋白的折叠或是参与信号转导的方式在盐芥的耐盐应答过程中发挥作用。
在本论文的另一部分工作中,对从拟南芥中分离的编码富含甘氨酸蛋白(GRP)的AtGRP9基因进行了研究,该基因的表达受盐诱导。AtGRP9启动子驱动的GUS和GFP定位显示AtGRP9在根的维管束中特异表达。酵母双杂交实验表明AtGRP9能和AtCAD5相互作用,后者是拟南芥中参与木质素合成的关键酶之一:肉桂醛脱氢酶。AtCAD5基因表达的器官特异性和组织特异性与AtGRP9基因相似,亚细胞定位进一步表明AtGRP9是一个细胞壁蛋白而AtCAD5是一个和细胞壁关联的细胞膜蛋白。这些结果暗示AtGRP9可能在拟南芥中通过与AtCAD5的相互作用参与了盐胁迫下的木质素合成。
综上所述,本论文获得了三个方面的研究结果:1)利用裂殖酵母表达系统从盐芥中分离得到52个耐盐相关基因,在酵母中过量表达这些基因能提高酵母细胞的耐盐性,这表明裂殖酵母是一种简单,快捷,行之有效的耐盐相关基因分离系统。2)对ThCYP1基因进行了耐盐相关功能性鉴定,首次证实单结构域的cyclophilin基因的过量表达能提高植物细胞的耐盐性。3)对AtGRP9基因的根维管束表达的特异性、AtGRP9蛋白和AtCAD5蛋白的相互作用及它们的亚细胞定位进行了研究,这也是首次对两者之间的相互作用进行报导,为木质素合成在盐胁迫应答中的作用提供了新的实验依据。