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研究背景/目的:骨肿瘤的发生与干细胞的增殖与分化失衡有关,但其机制尚未阐明。随着人类基因组计划的完成,非编码RNA对疾病发生的调控作用越来越受到关注,但其机制尚不清楚。基于此,我们自主研发并构建了具有19个随机碱基的RNA文库,用于筛选并鉴定调控干细胞增殖与分化失衡的非编码RNA,并研究相应非编码RNA的具体调控机制,最终为治疗骨肿瘤提供理论和实验基础。方法:(1)将具有19个碱基的RNA文库(n19 RNA library)通过逆转录病毒系统导入鼠胚胎成纤维细胞(i MEFs)中得到i MEFn19细胞,以BMP9诱导干细胞分化为模型,在体外用BMP9诱导i MEFn19分化,并裸鼠皮下注射异位成骨,3-4周后收取异位成骨包块,提取可贴壁生长的细胞,命名为i MEFOR1A(Osteogenic Resistance,OR)细胞,通过体外扩增,继续用BMP9诱导其分化并皮下注射,再提取可贴壁细胞,体内外扩增和筛选4次,分别命名为i MEFOR1A,i MEFOR1B,i MEFOR1C和i MEFOR1D,以仅导入n19 RNA文库而未经筛选的细胞(i MEFn19)作为对照。(2)体外培养扩增抗分化细胞和对照组细胞,运用碱性磷酸酶(ALP)染色和读数检测其早期成骨分化能力;Alizarin染色检测晚期成骨分化能力;Tq PCR检测干性指标和成骨分化标志物;裸鼠皮下异位成骨模型检测体内成骨能力。(3)提取抗分化细胞基因组DNA,运用高通量二代测序测定RNA序列,分析并提取高度富集的片段命名为DON(Disruptors of Osteogenesis induced by BMP9)。运用碱性磷酸酶(ALP)染色和读数检测早期成骨分化能力;Alizarin染色检测晚期成骨分化能力;裸鼠皮下异位成骨模型检测体内成骨能力。(4)运用RNA测序(RNA-Seq)测定并分析比较i MEFn19细胞与i MEFOR1B细胞在基因组水平基因的表达差异;Tq PCR验证相应基因在抗分化细胞中的表达;RNA Pull-down证实DON3与相应非编码RNA的结合。(5)选取长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)H19作为进一步研究对象,Tq PCR检测lnc RNA H19在BMP9诱导的i MEFn19细胞与i MEFOR1B细胞中的表达差异;Tq PCR检测BMP9诱导的i MEFn19细胞与i MEFOR1B细胞成骨分化因子的表达差异;体内外验证外源性过表达lnc RNA H19对i MEFOR1B体内外成骨分化的影响;外源性激活Notch信号通路对i MEFOR1B体内外成骨分化的影响。(6)检测在BMP9诱导的干细胞成骨分化过程中,lnc RNA H19的表达情况;通过体外实验验证过表达或沉默lnc RNA H19对BMP9诱导的干细胞早期和晚期成骨分化的影响;通过体内异位成骨模型了解过表达或沉默lnc RNA H19对干细胞成骨分化的影响;运用逆转录病毒系统构建稳定过表达或沉默lnc RNA H19的细胞系i MEF-Sim H19,i MEF-H19,i MEF-SEB作为对照,通过Ad NICD1激活Notch信号通路,了解Notch信号通路对BMP9诱导i MEF-Sim H19和i MEF-H19细胞株早期和晚期成骨分化和体内异位成骨的影响;通过免疫荧光和Western blot了解过表达或沉默lnc RNA H19对Notch信号通路激活的影响;Tq PCR检测过表达或沉默H19对Notch配体和受体表达的影响;Tq PCR测定BMP9诱导的干细胞成骨分化过程中Notch信号通路相关microRNA的表达情况和过表达或沉默lnc RNA H19的细胞中Notch信号通路相关micro-RNA的表达情况。(7)检测在BMP9诱导的干细胞成骨分化过程中,Notch受体和配体的表达情况;通过Ad NICD1激活Notch信号通路,了解NICD1对BMP9诱导的早期和晚期成骨分化和成血管的影响;通过Addn Notch1竞争性抑制Notch信号通路,了解抑制Notch信号通路对成骨分化的影响;运用裸鼠体内异位成骨模型,在加或不加polyethylene glycol citrate-co-N-isopropylacrylamide(PPCN)+Gelatin(PPCNg)在4周和6周分别了解激活Notch信号通路与抑制Notch信号通路对BMP9诱导干细胞成骨与成血管的影响。结果:(1)我们自主创新构建的RNA文库,深度测序结果提示多样性达到2.4X107,有效性达到90%,能够有效转染目的细胞;通过体外诱导和体内成骨实验多轮的筛选可以得到抗分化细胞系。(2)体外研究证实与i MEFn19细胞相比,在BMP9刺激下i MEFOR细胞早期和晚期成骨分化能力以及成骨分化标志物表达较对照组明显降低,体内实验证实i MEFOR细胞的成骨能力随着筛选次数的增加而逐渐降低,并伴有大量不分化细胞;在不加任何生长因子刺激下i MEFOR细胞具有不断增殖的能力;其表型与骨肉瘤的表型相类似。(3)通过高通量二代测序和数据分类分析挑选高度富集的单个RNA片段,分别命名为DON2、DON3、DON5、DON6、DON7;利用Piggy Bac转座子系统可将单片段导入回i MEFs细胞中,体外实验证实DON具有不同程度的抗早期和晚期成骨分化能力,而其抗成骨分化能力强弱与富集程度有关;体内实验也证实DON3和DON6具有让细胞重新具备增殖能力的特点,且具有明显的抗成骨分化特性。(4)全基因组RNA测序的结果表明,i MEFOR1B细胞与i MEFn19细胞相比在基因水平174个基因上调和517个基因下调;在非编码RNA水平有12个lnc RNA上调和14个lnc RNA下调;我们重点关注lnc RNA,通过Tq PCR证实在i MEFOR细胞中RNA测序相关的lnc RNA表达情况,选取变化最明显的lnc RNA H19做进一步研究;RNA pull-down证实DON3与lnc RNA的结合。(5)在BMP9的刺激下,与对照组相比,lnc RNA H19在i MEFOR1B中呈持续性的低表达,而这一情况与在BMP9刺激下i MEFOR1B成骨分化标志物的低表达相符合;在i MEFOR1B细胞中,过表达lnc RNA H19并不能补救i MEFOR1B的早期和晚期成骨分化缺陷,体内细胞移植也证实单纯过表达lnc RNA H19并不能补救i MEFOR1B在BMP9刺激下的成骨分化缺陷。在BMP9诱导的i MEFOR1B细胞成骨分化过程中激活Notch信号通路可部分补救i MEFOR1B的早期和晚期成骨分化缺陷和体内骨形成缺陷。(6)Lnc RNA H19在BMP9诱导的成骨分化过程中,与对照组相比,呈早期增高,然后下降,再维持在一个较低水平,同时逐渐增高的回到基线的趋势,提示lnc RNA H19在成骨分化过程中存在动态平衡的表达;在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中,沉默lnc RNA H19的表达,可以抑制BMP9诱导的早期和晚期成骨分化和成骨标志物表达;在BMP9诱导的MSCS成骨分化过程中,过表达lnc RNA H19,也可以抑制BMP9诱导的早期和晚期成骨分化和成骨标志物表达;体内异位成骨实验也证实,无论是过表达或沉默lnc RNA H19都可以使BMP9诱导的成骨分化受阻。在lnc RNA H19沉默或过表达的细胞中,外源性的激活Notch信号通路可以补救lnc RNA H19表达失衡导致的早期和晚期成骨分化受阻,体内异位成骨实验也证实,激活Notch信号通路可以补救过表达或沉默lnc RNA H19导致的成骨分化受阻。沉默或过表达lnc RNA H19可使Notch信号通路的激活受阻,而lnc RNA H19调控Notch信号通路的方式可能是通过调节Notch信号通路相关的micro-RNA实现的。(7)在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中,Notch受体和配体在中晚期增高;通过Ad NICD1激活Notch信号通路可以促进BMP9诱导的早期、晚期成骨分化和成骨分化标志物的表达;Addn Notch1抑制Notch信号通路的激活,也可以抑制BMP9诱导的早期、晚期成骨分化和成骨分化标志物的表达;体内异位成骨实验表明Notch信号通路促进骨形成主要是通过促进成骨-成血管偶联及新生血管长入实现的。结论:(1)以BMP9诱导的MSCs成骨分化为模型,利用RNA文库可以成功获得类骨肿瘤表型的抗分化细胞,MSCs增殖与分化的平衡被打破可导致骨肿瘤的发生。(2)通过RNA文库,可以发现调控成骨分化和骨肿瘤相关的起调控作用的lnc RNA,这些lnc RNA对成骨分化的调控导致了类骨肉瘤表型的抗分化细胞的出现。(3)Lnc RNA H19的表达平衡对BMP9诱导的成骨分化非常重要;lnc RNA H19通过调控Notch信号通路的活性实现对BMP9诱导的MSCs成骨分化的调控,而这一调控可能是通过调控Notch相关的micro-RNA实现的。(4)Notch信号通路通过促进成骨-成血管偶联调控BMP9介导的成骨分化和骨形成,这一发现可为构建组织工程骨与软骨提供新的策略。