论文部分内容阅读
目的
阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一种发生于中老年的以进行性认知障碍和记忆能力下降为主的退行性神经病变。其典型的病理改变是神经细胞间出现大量以β-淀粉样肽(β-Amyloid,Aβ)为核心的老年斑(senile plaques,SP)、神经元的胞体中出现神经原纤维缠结(neurofibriliar),tangles,NFT)等。关于AD的发病机制目前尚未完全阐明,但大量研究表明AD是多病因相互作用的结果,其中Aβ的沉积被认为是AD发病的关键环节。Aβ的蓄积造成自由基形成,氧化应激增强,脑内神经炎症,进一步引起神经细胞凋亡,最终导致神经元障碍或死亡。
AD脑中的神经细胞死亡主要是以凋亡形式发生的。有研究发现AD患者的诸多脑区,包括大脑皮层,基底前脑以及海马等都出现了明显的病理改变和细胞凋亡现象,炎症反应失调可能参与到AD病程的发生和发展的过程中。胶质细胞(主要指星形胶质细胞和小胶质细胞)在AD神经炎症病理过程中发挥着重要的作用。Aβ能够以直接和间接的形式激活胶质细胞,产生大量炎症介质,如TNFα,IL-1β等[47],作用于其受体TNFR1和IL-1R1并使其活化,继而iNos被激活,并产生活性氮簇(reactive nitrogen species,RNS)和NO。同时,在炎症作用下,毒性氧自由基也大量产生,引起氧化应激增强。ROS又能够与RNS反应形成过亚硝酸盐,这种产物对细胞有很强的毒性,可引起细胞凋亡。在神经细胞中,JNK是炎症和氧化应激等应激信号最易激活的激酶,也是许多神经退行性疾病细胞凋亡的关键步骤之一。激活JNK是介导神经元死亡的关键步骤,进一步引起其下游的一系列事件。
在某些抗原的刺激下,星形胶质细胞被激活,而后释放大量神经营养因子和抗炎介质。脑内发生神经炎症反应时,NTFs的水平也发生变化。当神经元不能获得足够量的NTFs,或NTFs的调节功能丧失时,神经系统就处于认知功能障碍和神经退行性变的风险,程序性细胞死亡就会启动。TrkA、TrkB受体都是通过自身磷酸化,从而活化MAPK/ERK通路和PI3K/Akt通路,从而作用于其下游的效应分子CREB、GSK3β。CREB不仅调节神经元生长发育,参与神经元突触可塑性、长时程记忆(LTM)的形成过程,通过磷酸化激活后调节目的基因的转录,而且还可以阻断Ap的寡聚化和形成。GSK3β的活化也会导致APP和Aβ堆积。
研究并建立可靠的AD动物模型对于探明AD的病因、发病机制及防治药物的研发均有重要的意义。APP/PS1小鼠在9个月时脑部即出现较多的Aβ表达及大量的Aβ沉积,呈现明显的AD的病理改变。行为学检测发现该小鼠在7月龄时即出现明显的学习记忆障碍,可部分的反映了AD的行为异常。因此,该转基因小鼠模型成为重要的用于AD发病及治疗研究的动物模型。
目前,对于AD的治疗缺乏有效、低毒的手段,越来越多的研究将重点移向具有药理活性的天然药物上,对于多病因,机制复杂的疾病往往具有“霰弹”效果。(-)表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶的一种主要多酚成分,研究证实绿茶有效的铁螯和、抗氧化、抗炎、抗癌及神经保护等作用的发挥主要依赖于EGCG。但EGCG对于APP/PS1转基因小鼠的研究与机制探讨尚无相关报道。
因此,本研究以APP/PS1转基因小鼠为对象,采用Niss1、TUNEL染色、免疫组化、Western blot等方法研究EGCG对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力、病理改变、细胞凋亡的影响,并分别从抗炎抗氧化、神经营养因子及其功能性受体引发下游ERK、AKT抗凋亡相关通路及其作用蛋白CREB、GSK3β的角度对EGCG发挥抗凋亡作用机制进行进一步的探讨。
材料与方法
取12月龄C57BL/6J小鼠10只作为对照组(WT,等量双蒸水每日1次,连续灌胃4周);12月龄APP/PS1小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组:模型组(APP/PS1,等量双蒸水每日1次,连续灌胃4周)、EGCG低剂量组(EGCG-2mg/kg组,每日按2mg/kg灌胃0.04%的EGCG1次,连续给药4周)、EGCG高剂量组(EGCG-6mg/kg组,每日按6mg/kg灌胃0.04%的EGCG1次,连续给药4周)、美金刚阳性对照组(Memantine组,每同按5mg/kg灌胃0.05%的美金刚1次,连续给药4周)、维生素E阳性对照组(VitE组,APP/PS1转基因小鼠10只,每日按280IU/kg灌胃1.87%的维生素E次,连续给药4周)。最后1周对小鼠进行Morris水迷宫、被动避暗试验及自主活动等行为学检测,其间继续给药。行为学结束后,各组小鼠断头处死,迅速取出大脑,一半放入4%多聚甲醛中固定,常规石蜡包埋,切片,用于常规HE染色、尼氏染色、TUNEL染色及APP、Aβ1-42、pCREB、GFAP等指标免疫组化的检测,另一半用于CAT、SOD、GSH-Px酶活性、MDA、H2O2及NO含量的测定及Western blot印迹分析APP、Aβ1-42、GFAP、IL-1、TNFα、IL-1R1、TNFR1,iNOS,pJNK2,JNK2,P53,BDNF,NGF,pTrkA,TrkA,pTrkB,TrkB,ERK1/2、p-ERK1/2、c-Raf,p-c-Raf,p-PI3K、PI3K、AKT1/2、p-AKT1/2、p-CREB、CREB、GSK3β及p-GSK3β等蛋白表达水平。
实验结果
1、EGCG对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的影响
EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组可明显缩短Morris水迷宫试验中APP/PS1转基因鼠水迷宫逃避潜伏期和寻找平台的路径长度(P＜0.01),并延长在原平台所在象限的停留时间和缩短原平台所在位置的次数(P＜0.01);亦可明显延长被动避暗试验中APP/PS1转基因鼠的避暗潜伏期(P＜0.01),并减少其穿梭明暗箱的错误次数(P＜0.01);但在自主活动试验中,各组无论是自主活动次数还是站立次数均无明显统计学差异(P＞0.05);说明EGCG可明显改善APP/PS1转基因鼠的学习记忆障碍,但活动能力未受影响;其程度与阳性药物组相当。
2、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑组织病理改变的影响
HE染色及Niss1染色结果显示,APP/PS1小鼠大脑皮层及海马区神经元数量明显减少,细胞排列松散,尼氏体分界不清,可见坏死的神经元;EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组和VitE组均明显的减少了神经元损伤程度。EGCG两剂量组减少神经元损伤程度与阳性药物组相当。
3、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ1-42及APP蛋白表达的影响
Aβ1-42及APP蛋白免疫组化及Western Blot结果显示APP/PS1小鼠大脑皮层及海马区的Aβ1-42及APP蛋白表达水平显著增高(P＜0.01);EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组和VitE组小鼠大脑皮层及海马区的Aβ1-42及APP蛋白蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)。EGCG两剂量组与阳性药物组无显著差异(P＞0.05)。
4、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑区神经元细胞凋亡的影响
TUNEL法染色结果显示APP/PS1小鼠脑区可见有较多的凋亡细胞,且细胞凋亡指数与WT组相比明显增多(P＜0.01);EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组和VitE组可明显抑制APP/PS1小鼠脑区神经元细胞的凋亡(P＜0.01)。
5、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内胶质细胞活化的影响
GFAP蛋白免疫组化及Western Blot结果显示APP/PS1小鼠脑内的GFAP表达水平显著增高,活化程度高(P＜0.01);EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组APP/PS1小鼠脑内的GFAP表达水平明显低于APP/PS1组小鼠,活化程度低(P＜0.01)。但VitE组与APP/PS1组相比,脑内胶质细胞的活化无显著差别(P＞0.05)。
6、EGCG对APP/PS1转基因小鼠炎症因子及其受体的影响
Western blot结果可见,APP/PS1转基因小鼠海马炎性因子IL-1β及其受体IL-1R1,TNFα及其受体TNFR1的表达较WT组明显增加(P＜0.01);EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组小鼠海马区炎性因子IL-1β及其受体IL-1R1,TNFα及其受体TNFR1的表达水平明显降低(P＜0.01)。但VitE组与APP/PS1组小鼠海马炎性因子及其相关受体的活化无显著差别(P＞0.05)。
7、EGCG对APP/PS1转基因小鼠iNOS表达及NO含量的影响
与WT组小鼠相比,APP/PS1转基因小鼠脑内iNOS表达明显增加(P＜0.01),NO含量亦明显增加(P＜0.01);与APP/PS1小鼠相比,EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组和VitE组小鼠脑内iNOS表达明显降低(P＜0.01),NO含量随之降低(P＜0.01)。EGCG治疗组(2mg/kg,6mg/kg)与两阳性药物对照组无显著统计学差别(P＞0.05)。
8、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内CAT、SOD、GSH-Px酶活性及H2O2、MDA含量的影响
APP/PS1模型组小鼠脑内抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性比WT组小鼠明显降低(P＜0.01),过氧化产物MDA及H2O2含量明显升高(P＜0.01);而EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组、VitE组与APP/PS1模型组比较,抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性明显升高(P＜0.01),过氧化产物MDA及H2O2含量明显降低(P＜0.01)。EGCG治疗组(2mg/kg,6mg/kg)与两阳性药物对照组无显著统计学差别(P＞0.05)。
9、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内抗凋亡通路JNK2/P53的影响
与WT组相比,APP/PS1组小鼠海马磷酸化JNK2蛋白表达明显增强,但不影响总蛋白的表达水平,使磷酸化JNK2与总JNK2蛋白比值明显增加(P＜0.01),其下游P53蛋白表达也明显增加(P＜0.01)。而EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组及VitE阳性对照组小鼠海马磷酸化JNK2蛋白较APP/PS1组表达明显降低,总蛋白水平不变,使磷酸化JNK2与总JNK2蛋白比值较APP/PS1组明显降低(P＜0.01),P53蛋白表达亦明显降低(P＜0.01),这提示了EGCG可能通过抑制凋亡通路JNK2蛋白的活化,抑制P53蛋白表达,从而抑制其脑内神经细胞的凋亡。EGCG治疗组(2mg/kg,6mg/kg)与两阳性药物对照组无显著统计学差别(P＞0.05)。
10、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内神经营养因子表达水平的影响
与WT组比,APP/PS1组小鼠海马内NGF、proNGF、BDNF蛋白表达水平明显降低(P＜0.01),表明APP/PS1转基因小鼠海马内神经营养因子的匮乏状态;与APP/PS1组对比,EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、及memantine组及VitE阳性对照组小鼠海马NGF、proNGF、BDNF蛋白表达水平明显升高(P＜0.01),表明EGCG可以改善APP/PS1小鼠海马内NGF的匮乏状态。EGCG治疗组(2mg/kg,6mg/kg)与两阳性药物对照组无显著统计学差别(P＞0.05)。
11、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内神经营养因子受体TrkA、TrkB表达水平的影响
与WT组相比,APP/PS1组小鼠海马磷酸化TrkA、TrkB蛋白表达明显降低,但不影响总蛋白的表达水平,使p-TrkA/TrkA、pTrkB/TrkB蛋白比值明显降低(P＜0.01)。而EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组及VitE阳性对照组小鼠海马磷酸化TrkA、TrkB蛋白较APP/PS1组表达显著增高,总蛋白水平不变,使p-TrkA/TrkA、pTrkB/TrkB蛋白比值较APP/PS1组明显增高,这提示了EGCG可能通过激活TrkA、TrkB,从而抑制其脑内神经细胞的凋亡。EGCG治疗组(2mg/kg,6mg/kg)与两阳性药物对照组无显著统计学差别(P＞0.05)。
12、EGCG对APP/PS1转基因小鼠APP/PS1转基因小鼠海马c-Raf/ERK通路的影响
APP/PS1组小鼠海马内c-Raf和ERK1/2磷酸化水平明显降低,而总蛋白水平基本保持不变,磷酸化蛋白与总蛋白比值明显降低(P＜0.01);而与APP/PS1组对比,EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组及VitE组可增加APP/PS1组小鼠海马内c-Raf、ERK1/2的磷酸化水平,而并不改变总蛋白的水平,磷酸化蛋白与总蛋白比值明显升高(P＜0.01),说明EGCG可通过激活c-Raf/ERK通路而发挥其抗凋亡作用。EGCG治疗组(2mg/kg,6mg/kg)与两阳性药物对照组无显著统计学差别(P＞0.05)。
13、EGCG对APP/PS1转基因小鼠APP/PS1转基因小鼠海马PI3K/AKT通路的影响
与WT组比,APP/PS1组小鼠海马内PI3K和AKT1/2磷酸化水平明显降低,而总蛋白水平基本保持不变,磷酸化蛋白与总蛋白比值明显降低(P＜0.01);而与APP/PS1组对比,EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、memantine组可增加APP/PS1组小鼠海马内PI3K和AKT1/2的磷酸化水平,而并不改变总蛋白的水平,磷酸化蛋白与总蛋白比值明显升高(P＜0.01)。与此不同,VitE阳性对照组小鼠海马内PI3K和AKT1/2的磷酸化水平与APP/PS1组相比未见显著差异(P＞0.05)。
14、EGCG对APP/PS1转基因小鼠APP/PS1转基因小鼠海马ERK、AKT通路下游效应蛋白CREB和GSK3β的影响
WesternBlot和免疫组化结果显示,与WT组比,APP/PS1组小鼠海马内CREB的磷酸化蛋白表达水平明显降低,总蛋白水平不变,而p-CREB与CREB比值降低(P＜0.01);而与APP/PS1组对比,EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组、及memantine组及VitE阳性对照组小鼠海马CREB的磷酸化蛋白表达水平显著升高,总蛋白无显著改变,p-CREB与CREB比值升高(P＜0.01)。EGCG治疗组(2mg/kg,6mg/kg)与两阳性药物对照组无显著统计学差别(P＞0.05)。
GSK3β与WT组比,APP/PS1组小鼠海马内GSK3β的磷酸化蛋白表达水平明显降低,总蛋白水平不变,其磷酸化蛋白与总蛋白比值显著升高(P＜0.01);而与APP/PS1组对比,EGCG-2mg/kg组、EGCG-6mg/kg组及memantine组小鼠海马GSK3β的磷酸化蛋白表达水平显著降低,总蛋白无显著改变,磷酸化与总蛋白比值降低(P＜0.01)。而VitE阳性对照组GSK3β的磷酸化蛋白表达水平并无显著增高(P＞0.05)。
结论
1、EGCG可显著改善APP/PS1转基因AD模型小鼠学习记忆障碍,并降低APP/PS1小鼠的大脑皮层及海马内的Aβ1-42及APP蛋白的沉积。
2、EGCG可通过抑制APP/PS1小鼠脑内神经细胞的凋亡来发挥神经保护作用。
3、EGCG可显著降低APP/PS1转基因小鼠脑内胶质细胞的活化,并通过降低APP/PS1小鼠的大脑海马炎性因子IL-1β、TNFα及其受体IL-1R1、TNFR1,抑制iNOS的表达,降低NO的水平,同时升高抗氧化酶和降低氧化应激产物,进而抑制APP/PS1小鼠脑内JNK2的活化,下调P53蛋白表达,发挥抗凋亡作用。
4、EGCG可显著升高APP/PS1转基因小鼠BDNF及NGF的表达水平,促进其高亲和力功能性受体TrkA和TrkB的活化,继而激活其下游c-Raf/ERK和PI3K/AKT通路的活化,而发挥其抗凋亡作用。
5、EGCG可通过c-Raf/ERK和PI3K/AKT通路的活化,使其作用底物CREB磷酸化增强,并同时使其另一底物GSK3β磷酸化降低,从而共同抑制APP的表达、Aβ的堆积,进而发挥抗凋亡的作用。