论文部分内容阅读
酪氨酸羟化酶是一类以L-Tyr为底物,通过在L-Tyr的苯环上发生邻位羟基化生成L-DOPA的酶,L-DOPA是脑黑质多巴胺生物合成的前体化合物,而多巴胺又是儿茶萘酚,去甲肾上腺素和肾上腺素的前体物质。该酶是这些生物机体重要物质合成的限速酶,对机体的神经系统及中央神经系统具有重要的影响。因此,对酪氨酸羟化酶的研究具有广泛的医学研究价值。人和大多数动物机体中的酪氨酸羟化酶是以四氢生物喋呤作为其辅因子,只有少数的几种细菌体内的酪氨酸羟化酶是以血红素做为其辅因子,本课题中采用的就是一种以血红素b作为其辅因子的酪氨酸羟化酶。该酶来源于S.refuineus,是该菌种合成安曲霉素的限速酶。1.本课题通过分子生物学的常规方法构建了酪氨酸羟化酶的pET-28a-Orfl 3的融合表达载体,并对其表达条件诱导温度,溶氧量,诱导剂浓度,以及诱导时间进行了优化,并探究了不同表达条件下对酶活性的影响。得到了该酶的最适表达条件,即25℃,0.1 mM IPTG,装液量为40%,诱导8 h,可以得到相对活性较高的酪氨酸羟化酶。2.为了使酶的纯化方法更简单,成本更低,本课题引入了类弹性蛋白纯化标签ELP60,分别将ELP60连在Orf13的C末端和N末端,构建了表达载体pET-Orfl 3-ELP60和pET-28a-ELP60-Orfl3。并对其对酪氨酸羟化酶的活性影响进行了探究,对其表达条件进行了一定的优化,发现Orfl 3-ELP60的最适表达条件为25℃,0.2 mM IPTG,30%装液量诱导8h可以达到相对活性较高的酪氨酸羟化酶,ELP60-Orfl 3的最适表达条件为30℃,0.1 mM IPTG,40%装液量诱导表达8h可以得到相对活性较高的酪氨酸羟化酶。并且还发现当ELP60连在Orfl 3的C末端时其相对活性明显高于将其连在Orfl 3的N末端,且其纯化效果也相对较高。因此,试验中活性探索均采用Orfl 3-ELP60为目的蛋白进行研究。3.由于该酪氨酸羟化酶的催化过程中需要H202作为羟基供体,为了使反应中持续提供H2O2,试验中引入了D-氨基酸氧化酶(DAAO) DAAO以D-氨基酸为底物催化并生成H202,氨和相应的α-酮酸盐,因此DAAO的引入,可以使反应持续进行,直至底物L-Tyr完全转化。试验中发现DAAO的引入极大的促进了L-Tyr的转化,使反应可以在比较短是时间内完成。为了使L-Tyr达到最大的转化率,实验中对两种底物L-Tyr与D-Ala的不同的浓度比例进行了研究,发现当D-Ala的浓度低于L-Tyr浓度时,L-Tyr不能在短时间内得到较高的转化,而当D-Ala与L-Tyr浓度相同,或高于L-Tyr的浓度时,均能使L-Tyr的转化在短时间内达到90%以上。