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非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌的生物学行为、治疗方式和预后均有明显差异。在手术前准确判断肿瘤是否发生肌层浸润,对膀胱癌的治疗方案选择以及预后判断至关重要。目前,临床术前判断膀胱癌是否发生肌层浸润主要依靠膀胱镜和影像学(CT或MRI)检查,但这些方法均有一定的局限性,尚不能充分满足临床实际需求。寻找合适的肿瘤分子标志物对膀胱癌进行分子分期已经成为辅助膀胱癌术前诊断的研究热点。本课题第一部工作在前期采用基因芯片技术获得的非肌层浸润性(16例)和肌层浸润性膀胱癌(14例)mRNA表达谱的基础上,分析两型膀胱癌之间的差异表达基因。首先,通过数据挖掘初筛获得11个显著差异表达基因(AK098422、APOLD1、 C13orf33、CYR61、HSD17B3、LIG4、NR4A2、PCK2、PLK3、RBMS3、RTN4);随后,以实时定量PCR (Realtime PCR)技术,对初筛所得基因在完成上述芯片分析的30例“起始样本”和另一组膀胱癌(54例)“独立样本”中依次进行了验证；最终有4个基因(AK098422、C13orf33、CYR61、RBMS3)在两型膀胱癌中仍显著差异表达。继而,针对其中差异表达最明显的基因CYR61,在115例膀胱癌福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织中进行了免疫组化染色,发现浸润性癌中的CYR61蛋白强阳性率显著高于非浸润性癌(p=0.001)；然而肿瘤组织中CYR61蛋白表达水平对于患者的无瘤生存期并无明显影响(p=0.571)。鉴于CYR61是典型的分泌蛋白,进而以酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定104例膀胱癌患者术前尿中的CYR61蛋白。结果提示,浸润性膀胱癌患者术前尿上清中的CYR61含量显著高于非浸润性癌患者,其鉴别诊断的敏感度为72.7%,特异度为86.0%,诊断效能优于MMP2、VEGF、VEGFC这3个已有报道的相关蛋白标志物；CYR61与此3个蛋白联合鉴别肌层浸润性膀胱癌的敏感性为87.9%,特异度为86.4%。此外,术前尿中CYR61蛋白水平对于膀胱癌肌层浸润的诊断效能亦优于影像学检查CT或MRI。本课题第二部分工作利用体外实验针对CYR61异常表达在膀胱癌侵袭过程中的作用及其表达增高的分子机制进行了探索。首先分析了不同膀胱癌细胞系中内源性CYR61的表达情况,证实浸润性癌细胞系的CYR61基因表达量高于非浸润性癌细胞系。随后的实验结果显示,外源性过表达CYR61基因可以促进浸润性膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力；反之,沉默CYR61表达可以抑制浸润性膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力；此外,CYR61表达变化可以调节浸润性膀胱癌细胞中MMP2、NRP1的表达。但是,在非浸润性膀胱癌细胞中CYR61的表达变化却并不影响细胞的侵袭和迁移能力,也不能调节非浸润性膀胱癌细胞中MMP2、NRP1的表达。基于前期工作的arrayCG H芯片分析数据,比较了非浸润性膀胱癌(29例)与浸润性膀胱癌(36例)中CYR61基因拷贝数,结果提示DNA拷贝数改变不是CYR61表达升高的原因。结合本实验室基于前期工作的microRNA表达谱芯片分析数据,筛选获得非浸润性和浸润性膀胱癌组织之间差异表达且与CYR61基因有关的3个miRNA,利用荧光双报告实验确定miR-30e可以结合CYR61基因3’UTR区域,调控膀胱癌细胞中CYR61的表达。进而以Realtime PCR检测了72例膀胱癌组织中miR-30e的表达,发现浸润性膀胱癌表达量低于非浸润性癌；而且肿瘤组织中的CYR61与miR-30e的表达量呈负相关；从而提示,miRNA-30e低表达可能是其靶基因CYR61在肌层浸润性膀胱癌中表达升高的原因。本项研究针对前期利用高通量技术分析数据获得的非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌之间的差异表达基因进行了两轮验证,以及相应的生物学功能探索。课题工作的主要新发现为,揭示了CYR61基因在膀胱癌组织中异常表达的临床意义,及其对于肿瘤浸润过程的作用；明确了尿上清液中CYR61蛋白术前辅助鉴别肌层浸润性膀胱癌的诊断价值,为CYR61作为新型肿瘤分子标志物的临床转化应用研究奠定了基础。