论文部分内容阅读
阿瑞匹坦（Aprepitant，Emend(R)）是一种神经激肽1(NK-1)受体拮抗剂，用于预防和治疗化疗引起的急性或延迟性呕吐。(R)-3，5-双三氟甲基-1-苯乙醇是该药物合成的一个关键手性醇中间体。微生物细胞或者微生物来源的羰基还原酶可以高效地催化前手性酮的还原，是制备手性醇分子的重要方法之一。目前文献报道了十多种微生物可以将3，5-双三氟甲基苯乙酮转化为(R)-3，5-双三氟甲基-1-苯乙醇，但是使用纯酶催化的例子很少，而且存在底物浓度低，反应时间长和立体选择性不高等缺点。因此，使用纯酶催化产生目标产物，开发出底物浓度高，催化效率高和立体选择性好的反应体系对于(R)-3，5-双三氟甲基-1-苯乙醇的合成具有重要意义。 本论文主要研究了ChKRED20的酶学性质以及该酶催化阿瑞匹坦重要手性醇中间体(R)-3，5-双三氟甲基-1-苯乙醇合成的反应体系优化。以金黄杆菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49)来源的短链脱氢酶ChKRED20为研究对象，通过该酶的异源表达和纯化，对其酶学性质进行表征;并使用ChKRED20粗酶液催化(R)-3，5-双三氟甲基-1-苯乙醇的合成，优化生物催化反应体系，为阿瑞匹坦关键中间体工业化生产奠定基础。 本论文的主要研究结果如下:（一）、ChKRED20的最适催化温度为50℃，最适pH为8.0; ChKRED20具有良好的热稳定性，在40℃条件下，半失活周期达到163h;多种金属离子(1mM)，有机溶剂(10％)及其他化学试剂如还原剂，金属离子螯合剂(5mM)等对酶活力的影响较小;在部分添加剂如Tween-80，Ni2+存在的条件下，酶的活力有所提高，最高可达168％;此外，底物谱的研究表明，该酶对多种含氟的苯乙酮衍生物如3，5-二氟甲基苯乙酮，3，4，5-三氟甲基苯乙酮等具有很高的催化活性，转化率＞99％，且ee＞99％;（二）、ChKRED20粗酶液可以高效地催化3，5-双三氟甲基苯乙酮还原为(R)-3，5-双三氟甲基-1-苯乙醇。ChKRED20粗酶液可以耐受高达70％(v/v)的异丙醇;反应体系中无需加入价格昂贵的还原型辅NAD(P)H，ChKRED20粗酶液本身可以进行高效地辅酶循环;优化后的结果显示，6g/L的粗酶液在40℃的条件下，24h内可转化400g/L的底物，转化率达95.2％，ee值＞99％，产物的时空效率从原来的150g/L/d提高到380g/L/d。 ChKRED20可以催化3，5-双三氟甲基苯乙酮的anti-Prelog还原，对于阿瑞匹坦中间体(R)-3，5-双三氟甲基-1-苯基乙醇的生物催化法合成研究具有重要的意义。而且ChKRED20表现出了常温微生物中的氧化还原酶所不具备的热稳定性及有机溶剂耐受性。利用ChKRED20粗酶液作为生物催化剂生产阿瑞匹坦的关键手性中间体具有很大的工业应用潜力。作为一个新型的anti-Prelog还原酶，ChKRED20对多种苯乙酮衍生物具有催化作用且保持极好的立体选择性，是对羰基还原酶库的一个重要补充。