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酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(Acyl-coenzyme A:cholesterolacyltransferase，ACAT)是细胞内唯一催化游离胆固醇和长链脂肪酸合成胆固醇酯的酶，在体内胆固醇代谢平衡过程中起到关键的调控作用。我们实验室已报道人ACAT1 cDNA K1对应的4.3-kb mRNA来源于1号和7号两条染色体，并且利用GGC1274-1276和AUG1397-1399密码子翻译产生56-kD和50-kD两种活性不同的异构体酶。在这些研究的基础上，我的论文工作着重对人ACAT1的表达调控机制进行了深入探索研究，主要有三部分工作。 1.人ACAT156-kD异构体蛋白翻译产生的功能性RNA二级结构 首先研究分析GGC1274-1276密码子上下游序列形成的RNA二级结构，对从该密码子翻译产生人ACAT156-kD异构体蛋白的影响。RNA二级结构预测结果显示，在GGC1274-1276密码子上下游序列中存在三个stem-loop(nt1255-1268，1286-1342，1355-1384)。进而，通过将含有连接缺失型或突变型stem-loop的部分ACAT1或luciferase编码ORF的质粒转染细胞，并利用相应抗体进行western blot检测蛋白产物来探索这三个stem-loop对从GGC1274-1276密码子翻译产生蛋白的影响。结果显示，来自于7号染色体的stem-loop1255-1268以及1号染色体的stem-loop1286-1342，对于从GGC1274-1276密码子翻译产生人ACAT156-kD异构体蛋白是必不可少。进一步利用含有连接突变型茎环结构的部分ACAT1编码ORF的质粒转染细胞，western blot结果显示，GGC1274-1276密码子上游stem-loop1255-1268的AU组成和下游stem-loop1286-1342的高丰度GC，是这两个必不可少结构的特征性组成。该部分工作中，揭示了RNA二级结构在人ACAT156-kD异构体蛋白翻译产生过程发挥功能作用，为人ACAT1基因的转录后水平调控提供了证据。 2.人ACAT156-kD异构体蛋白特异N端序列及其编码mRNA的反式剪接 在实验室前期工作基础上，进一步探索从GGC1274-1276密码子翻译产生人ACAT156-kD异构体蛋白的分子机制。首先，将GGC1274-1276密码子突变为多种其它氨基酸密码子，结果显示均能从这些氨基酸密码子翻译产生56-kD及自下游同框AUG1397-1399翻译产生50-kD的ACAT1异构体蛋白。其中，将GGC1274-1276密码子突变为经典AUG起始密码子时，特别有兴趣地观察到在56-与50-kD之间额外多出一蛋白条带，并且提示此一分子量差异可能发生在人ACAT156-kD异构体蛋白的N端(ACAT1-NT56)。深入进行ACAT1-NT56-NT50-Flag融合蛋白和ACAT1-NT56-Rluc融合蛋白的表达分析结果显示，将GGC1274-1276密码子上下游紧邻的多个同框密码子分别突变为经典AUG起始密码子，也同样观察到比对照多出一中间大小的蛋白条带。这进一步提示，GGC1274-1276密码子突变为AUG密码子引起产生中间大小的额外蛋白条带，很可能由于人ACAT1-NT56导致的分子量差异。同时，利用上述含人ACAT1-NT56的表达产物，进行蛋白分子量比较分析表明，GGC1274-1276密码子突变为AUG密码子所多出的中间大小蛋白条带，确实是由于人ACAT1-NT56引起的分子量差异，暗示人ACAT156-kD异构体蛋白可能存在特异性N端序列。 进一步通过免疫沉淀、双向电泳纯化并进行深入的质谱鉴定和蛋白质N端序列测定，特别惊奇地发现人ACAT156-kD异构体蛋白确实存在特异性N端序列，即含有除GGC1274-1276密码子至下游AUG1397-1399的同框密码子所编码氨基酸以外的非ACAT1序列。通过蛋白文库比对分析表明，该非ACAT1序列来自于一假定性蛋白(Hypothetical protein，HP)N端序列。但是，与cDNA文库比对分析表明，已有各种生物（包括人、小鼠以及其它多种生物）来源HP cDNAs，并且均具有完全一致的ORF。通过对来自11种人细胞系、1种鼠细胞系和14份人肝癌及癌旁组织的基因组DNA进行PCR及其产物测序分析结果显示，在这些细胞系和至少5份人肝癌及癌旁组织中均检测到完全一致的HP ORF。同时，利用人、小鼠HP cDNAs与已公布的人、小鼠基因组序列进行对比分析结果显示，人12号和小鼠15号染色体分别仅仅只含有相应HPcDNA的ORF5′上游部分序列，表明各种HP cDNA来源生物的基因组并不都存在HP ORF。最后，通过与质粒序列比对分析表明，各种氨苄青霉素抗性的重组质粒均含有完全一致的HP ORF序列，并通过计算机预测和构建相关质粒转染人细胞分析，证实质粒HP ORF上游的序列存在一种真核启动子序列。 深入通过质粒转染人细胞瞬时表达、RT-PCR及其扩增产物序列测定发现，氨苄青霉素抗性重组质粒都能转录产生HP mRNA，而同时共表达人ACAT1 cDNA K1对应的mRNA时可检测到HP mRNA与人ACAT1 mRNA反式剪接的RNA产物，其通过剪接供体HP ORF的第46个密码子AGA与剪接受体人ACAT1 mRNA的GGC1274-1276密码子的反式剪接相连接，这两个位点的紧邻序列显示为典型的5′-与3′-剪接部位序列。同时，对剪接受体人ACAT1 mRNA的GGC1274-1276密码子上游3′-剪接部位序列CAG的详细突变分析，结果证明改变3′-剪接部位序列CAG完全影响人ACAT156-kD异构体蛋白的特异性N端序列产生。进而，通过质粒转染人细胞瞬时表达分析，结果肯定了含HP ORF的反式剪接人ACAT1 mRNA翻译产生相应56-kD异构体蛋白的特异性N端片段。 这部分工作结果发现，翻译产生的人56-kD异构体蛋白的编码mRNA，是人ACAT1 cDNA K1对应的跨染色体反式剪接mRNA与来源于氨苄青霉素抗性质粒（最先重组质粒为pBR322）的HP mRNA通过又一次反式剪接产生，证实了人ACAT1基因的Multiple trans-splicing调控表达，对深入揭示相应的分子机制和生物学功能都具有极其重要的意义。 3.糖皮质激素地塞米松增强人ACAT1表达与促进泡沫细胞形成 在巨噬细胞中，由于ACAT活性过高，可导致胆固醇酯大量堆积并形成泡沫细胞，即动脉粥样硬化早期病变。我们首先利用糖皮质激素地塞米松（dexamethasone，Dex）处理人单核细胞系THP-1来源的巨噬细胞，油红O染色显示即使在低浓度ox-LDL条件下，也显著促进泡沫细胞形成。利用ACAT抑制剂的实验结果表明，这种Dex促进泡沫细胞形成可被ACAT抑制剂特异性抑制。进一步RT-PCR和western blot结果显示，Dex提高人单核/巨噬细胞ACAT1基因表达。对人ACAT1基因P1启动子深入分析揭示，其含有一个糖皮质激素受体元件，进一步的缺失实验证实该元件响应地塞米松的刺激，从而提高ACAT1基因P1启动子活性。而后，通过凝胶阻抑分析(ElectrophoresisMobility Shift Assays，EMSA)实验证实，结合Dex配体的糖皮质激素受体确实能够结合ACAT1基因P1启动子上的糖皮质激素受体元件。该部分工作，为临床长期使用糖皮质类激素类药物而引起动脉粥样硬化冠心病人致死率提高的现象提供了分子、细胞水平的基础证据，并提示人ACAT1基因表达调控过程可能是降低动脉粥样硬化的关键性靶标。 本论文的三部分工作中，发现人ACAT156-kD异构体蛋白翻译产生过程的功能性RNA二级结构，发现含HP ORF的反式剪接人ACAT1 mRNA翻译产生相应56-kD异构体蛋白的特异性N端序列，揭示了糖皮质激素Dex提高人ACAT1基因表达从而促进泡沫细胞形成机制。这些在转录与转录后水平揭示了人ACAT1的表达调控机制，为深入探索ACAT在胆固醇代谢平衡中的生理功能、病理变化等机理提供了重要基础。