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目的：
膜联蛋白A2(AnnexinA2，AnnexinⅡ，ANXA2)的高表达是包括乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌及脑胶质瘤等在内的多种肿瘤细胞的共有特征之一，并与肿瘤发生发展的机制有重大关联。目前，对于ANXA2对肿瘤细胞实施影响的分子机制及潜在的分子间串话(Cross-talk)并不明确，且不同的细胞类型之间存在较大差异。本研究就ANXA2在脑胶质瘤细胞中的作用及潜在分子机制进行了深入的研究，旨在为实现神经胶质瘤细胞基因治疗奠定实验基础。
方法：
克隆了人类AnxA2编码序列，构建了ANXA2过表达及RNAi敲减的慢病毒表达载体，通过慢病毒感染的方法构建了稳定转染的ANXA2过表达及RNAi敲减的胶质瘤U251细胞模型，利用RT-PCR、Western-blot及细胞免疫荧光法检测了ANXA2过表达及RNAi干预的有效性；采用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术及裸小鼠荷瘤实验检测不同ANXA2表达背景下神经胶质瘤U251细胞增殖行为的差异；采用Western-blot、EMSA、药物抑制等方法初步探讨增殖相关的分子机制；采用流式细胞术评估细胞的凋亡情况，并用药物抑制及Western-blot、免疫荧光及免疫沉淀等方法开展对核转录因子NFκB-P65、Akt、Caspase3、PTEN与ANXA2之间在胶质瘤细胞凋亡调节方面的应答关系进行初步研究；采用划痕实验及含基质胶的Tranwell小室评估细胞的迁移和侵袭能力，并检测侵袭转移的主要效应分子MMPs的表达及功能情况。
结果：
通过慢病毒感染的方法成功构建了稳定转染的ANXA2过表达及RNAi敲减的胶质瘤U251细胞模型，ANXA2蛋白过表达增幅为42.7%±5.2%，p＜0.05，敲减幅度为72.2%±3.2%，p＜0.01。
对于ANXA2与胶质瘤细胞增殖相关性的研究结果表明ANXA2的敲减可显著抑制U251细胞的增殖能力；对其分子机制的初步研究发现，ANXA2的敲减对STAT3的表达没有影响，却显著降低pSTAT3(Y705)及CyclinD1的表达水平、下调pSTAT3(Y705)的转录活性，形成G1/S阻断；进一步的实验结果表明ANXA2可能通过与STAT3的直接结合而调控其磷酸化水平，进而影响pSTAT3-CyclinD1通路所介导的细胞增殖。相关实验在神经胶质瘤U87细胞株中得以重复，表明该机制在胶质瘤细胞中具有一定的代表性。另一方面，ANXA2过表达在MTT实验及裸鼠移植瘤实验中表现出显著的促增殖作用，却对克隆形成率、细胞周期及增殖相关的pSTAT3-CyclinD1通路未见显著影响。深入的研究发现敲减细胞的ANXA2再表达能够一定程度地恢复pSTAT3(Y705)的表达量，表明重组ANXA2结构完整功能正常，而ANXA2过表达无法激活pSTAT3(Y705)的原因可能是内源性ANXA2存在冗余；在EGF的诱导下，过表达的ANXA2可提升pSTAT3(Y705)的表达量，表明EGF与ANXA2对pSTAT3-CyclinD1通路的激活具有正向协同作用，提示MTT及裸鼠移植瘤实验中冗余ANXA2表现出的促增殖作用可能缘于旁分泌因子EGF的累积和协同作用。
对于ANXA2与胶质瘤细胞凋亡相关性的研究结果表明ANXA2过表达对U251细胞的凋亡及激活型Caspase-3没有明显抑制，提示ANXA2过表达细胞移植瘤体增大可能不是凋亡减少的结果；而在ANXA2敲减细胞中则观察到明显的凋亡增加及激活型Caspase-3的增加，提示ANXA2敲减细胞移植瘤体较小不仅缘于增殖抑制还有凋亡增多的贡献。对ANXA2调节Caspase-3分子机制的进一步研究结果显示：药物抑制pP65(S536)可增加激活型Caspase-3的表达及凋亡表型，pAkt(T308)磷酸化的药物抑制可下调pP65(S536)并上调激活型Caspase-3，ANXA2的敲减则既可抑制pAkt(T308)又可抑制pP65(S536)，而免疫沉淀的结果还表明ANXA2可与PI3K-Akt通路的阻断物PTEN直接结合。根据上述实验结果，对ANXA2敲减促进细胞凋亡的可能解释是：ANXA2的敲减导致PTEN的游离释放，后者阻断PI3K-Akt通路活化，抑制了pAkt(T308)形成，继而通过抑制IKKα下调pP65(S536)并导致激活型Caspase-3的增加和促进凋亡。对ANXA2过表达细胞未能抑制凋亡的可能解释是：PTEN作为抑癌基因在肿瘤细胞内含量极微，过表达细胞中多余的ANXA2无法结合更多的PTEN，因此也就没有表现出更为明显的凋亡抑制作用。
对于ANXA2与胶质瘤细胞侵袭转移能力的相关性的研究结果表明，ANXA2的过表达可促进具有活性的MMP2/9的分泌，而ANXA2敲减细胞则相反，ANXA2可通过影响活性MMP2/9分泌而对U251细胞的侵袭和转移产生正调控效应。
结论：
ANXA2可能通过与STAT3的直接结合而调控STAT3的磷酸化过程。ANXA2的敲减显著降低pSTAT3(Y705)及CyclinD1的表达水平、下调pSTAT3(Y705)的DNA结合活力，从而抑制pSTAT3-CyclinD1通路所介导的细胞增殖；ANXA2的过表达不影响pSTAT3-CyclinD1通路，但EGF与ANXA2在pSTAT3(Y705)的磷酸化激活过程中存在协同关系。人脑胶质瘤细胞中ANXA2可能通过PTEN-AKT-P65-Caspase3信号链发挥对凋亡的影响。同时，ANXA2可通过影响活性MMP2/9分泌而对胶质瘤细胞的侵袭和转移产生正调控效应。
膜联蛋白A2(AnnexinA2，AnnexinⅡ，ANXA2)的高表达是包括乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌及脑胶质瘤等在内的多种肿瘤细胞的共有特征之一，并与肿瘤发生发展的机制有重大关联。目前，对于ANXA2对肿瘤细胞实施影响的分子机制及潜在的分子间串话(Cross-talk)并不明确，且不同的细胞类型之间存在较大差异。本研究就ANXA2在脑胶质瘤细胞中的作用及潜在分子机制进行了深入的研究，旨在为实现神经胶质瘤细胞基因治疗奠定实验基础。
方法：
克隆了人类AnxA2编码序列，构建了ANXA2过表达及RNAi敲减的慢病毒表达载体，通过慢病毒感染的方法构建了稳定转染的ANXA2过表达及RNAi敲减的胶质瘤U251细胞模型，利用RT-PCR、Western-blot及细胞免疫荧光法检测了ANXA2过表达及RNAi干预的有效性；采用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术及裸小鼠荷瘤实验检测不同ANXA2表达背景下神经胶质瘤U251细胞增殖行为的差异；采用Western-blot、EMSA、药物抑制等方法初步探讨增殖相关的分子机制；采用流式细胞术评估细胞的凋亡情况，并用药物抑制及Western-blot、免疫荧光及免疫沉淀等方法开展对核转录因子NFκB-P65、Akt、Caspase3、PTEN与ANXA2之间在胶质瘤细胞凋亡调节方面的应答关系进行初步研究；采用划痕实验及含基质胶的Tranwell小室评估细胞的迁移和侵袭能力，并检测侵袭转移的主要效应分子MMPs的表达及功能情况。
结果：
通过慢病毒感染的方法成功构建了稳定转染的ANXA2过表达及RNAi敲减的胶质瘤U251细胞模型，ANXA2蛋白过表达增幅为42.7%±5.2%，p＜0.05，敲减幅度为72.2%±3.2%，p＜0.01。
对于ANXA2与胶质瘤细胞增殖相关性的研究结果表明ANXA2的敲减可显著抑制U251细胞的增殖能力；对其分子机制的初步研究发现，ANXA2的敲减对STAT3的表达没有影响，却显著降低pSTAT3(Y705)及CyclinD1的表达水平、下调pSTAT3(Y705)的转录活性，形成G1/S阻断；进一步的实验结果表明ANXA2可能通过与STAT3的直接结合而调控其磷酸化水平，进而影响pSTAT3-CyclinD1通路所介导的细胞增殖。相关实验在神经胶质瘤U87细胞株中得以重复，表明该机制在胶质瘤细胞中具有一定的代表性。另一方面，ANXA2过表达在MTT实验及裸鼠移植瘤实验中表现出显著的促增殖作用，却对克隆形成率、细胞周期及增殖相关的pSTAT3-CyclinD1通路未见显著影响。深入的研究发现敲减细胞的ANXA2再表达能够一定程度地恢复pSTAT3(Y705)的表达量，表明重组ANXA2结构完整功能正常，而ANXA2过表达无法激活pSTAT3(Y705)的原因可能是内源性ANXA2存在冗余；在EGF的诱导下，过表达的ANXA2可提升pSTAT3(Y705)的表达量，表明EGF与ANXA2对pSTAT3-CyclinD1通路的激活具有正向协同作用，提示MTT及裸鼠移植瘤实验中冗余ANXA2表现出的促增殖作用可能缘于旁分泌因子EGF的累积和协同作用。
对于ANXA2与胶质瘤细胞凋亡相关性的研究结果表明ANXA2过表达对U251细胞的凋亡及激活型Caspase-3没有明显抑制，提示ANXA2过表达细胞移植瘤体增大可能不是凋亡减少的结果；而在ANXA2敲减细胞中则观察到明显的凋亡增加及激活型Caspase-3的增加，提示ANXA2敲减细胞移植瘤体较小不仅缘于增殖抑制还有凋亡增多的贡献。对ANXA2调节Caspase-3分子机制的进一步研究结果显示：药物抑制pP65(S536)可增加激活型Caspase-3的表达及凋亡表型，pAkt(T308)磷酸化的药物抑制可下调pP65(S536)并上调激活型Caspase-3，ANXA2的敲减则既可抑制pAkt(T308)又可抑制pP65(S536)，而免疫沉淀的结果还表明ANXA2可与PI3K-Akt通路的阻断物PTEN直接结合。根据上述实验结果，对ANXA2敲减促进细胞凋亡的可能解释是：ANXA2的敲减导致PTEN的游离释放，后者阻断PI3K-Akt通路活化，抑制了pAkt(T308)形成，继而通过抑制IKKα下调pP65(S536)并导致激活型Caspase-3的增加和促进凋亡。对ANXA2过表达细胞未能抑制凋亡的可能解释是：PTEN作为抑癌基因在肿瘤细胞内含量极微，过表达细胞中多余的ANXA2无法结合更多的PTEN，因此也就没有表现出更为明显的凋亡抑制作用。
对于ANXA2与胶质瘤细胞侵袭转移能力的相关性的研究结果表明，ANXA2的过表达可促进具有活性的MMP2/9的分泌，而ANXA2敲减细胞则相反，ANXA2可通过影响活性MMP2/9分泌而对U251细胞的侵袭和转移产生正调控效应。
结论：
ANXA2可能通过与STAT3的直接结合而调控STAT3的磷酸化过程。ANXA2的敲减显著降低pSTAT3(Y705)及CyclinD1的表达水平、下调pSTAT3(Y705)的DNA结合活力，从而抑制pSTAT3-CyclinD1通路所介导的细胞增殖；ANXA2的过表达不影响pSTAT3-CyclinD1通路，但EGF与ANXA2在pSTAT3(Y705)的磷酸化激活过程中存在协同关系。人脑胶质瘤细胞中ANXA2可能通过PTEN-AKT-P65-Caspase3信号链发挥对凋亡的影响。同时，ANXA2可通过影响活性MMP2/9分泌而对胶质瘤细胞的侵袭和转移产生正调控效应。