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疟疾是世界上严重影响人类健康的公共卫生问题之一。由于疟原虫的免疫逃避,虫体在有免疫力的宿主体内仍能生存与繁殖,导致宿主产生的免疫保护不稳定。因此,研究疟原虫的免疫逃避机制对疟疾的预防和治疗具有重要意义。研究表明疟原虫的免疫逃避可能与输出蛋白和脾脏中的成纤维细胞相互作用有关。在筛选间日疟原虫未知蛋白发现PvEXP100(Plasmodium vivax exported protein 100)是间日疟原虫的输出蛋白之一,在此基础上观察PvEXP100对人脾脏成纤维细胞(human spleen fibroblasts,HSF)的作用,从而揭示间日疟原虫在脾脏中免疫逃避的机制。主要内容及结果如下:(1)PvEXP100功能区的筛选。构建重组质粒pEGFP-HSVg-D1-PvEXP100,转染至HEK293T细胞表达。通过Transwell观察PvEXP100对人脾脏成纤维细胞(HSF)迁移的作用,F1段能够引起HSF的大量迁移。构建原核表达重组质粒pET30a-PvEXP100-F1,得到纯蛋白进行后续实验。(2)PvEXP100-F1对HSF的作用。利用CCK-8法观察PvEXP100-F1对HSF增殖的影响,Transwell检测HSF的迁移情况。结果表明,PvEXP100-F1对HSF的增殖未见明显影响,但能促进HSF的迁移。Western blot检测MAPK信号通路的关键蛋白(ERK、JNK、p38)磷酸化水平均明显提高,说明MAPK信号通路被激活。通过流式细胞术和Western blot发现PvEXP100-F1与HSF结合,说明PvEXP100-F1通过诱导HSF的迁移并与其结合,可能参与间日疟原虫的免疫逃避。综上所述,PvEXP100-F1通过激活MAPK通路诱导HSF的迁移,并与其结合。该过程可能参与了间日疟原虫的免疫逃避。疟原虫感染可以使肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化,抑制肿瘤增殖、侵袭及转移,因此初步探讨了间日疟原虫蛋白PvEXP100的抗肿瘤作用及机制,为疟原虫在肿瘤治疗中的潜在应用提供的理论依据。(3)PvEXP100-F1对巨噬细胞的影响。显微镜观察发现PvEXP100-F1使巨噬细胞形态改变,流式细胞术检测表面标志物发现巨噬细胞向M1型极化。采用ELISA和反转录PCR(RT-PCR)检测一氧化氮(NO)、白细胞介素2(IL-2)、α肿瘤坏死因子(TNF-α)的分泌及相关细胞因子mRNA表达量的水平,PvEXP100-F1通过上调NO和细胞因子mRNA的表达水平增加NO和相应细胞因子的分泌。运用Western blot对MAPK信号通路的关键蛋白(ERK、JNK、p38)磷酸化水平的检测,发现均有提高。说明巨噬细胞的免疫调节与MAPK通路的激活密切相关。因此,PvEXP100-F1可以使巨噬细胞向M1型极化,并通过激活MAPK通路使其分泌炎性细胞因子。(4)PvEXP100-F1对肿瘤细胞的直接作用。CCK-8检测PvEXP100-F1对肝癌细胞(HepG2)的增殖影响,Transwell检测HepG2的迁移情况。结果表明,HepG2的增殖和迁移得到均被明显抑制。通过Western blot对细胞周期蛋白Cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和蛋白酶Caspase3的表达水平进行检测,PvEXP100-F1通过抑制Cyclin D1的表达,下调Bcl-2的表达,上调Bax、Caspase3的表达,促进HepG2细胞凋亡。因此,PvEXP100-F1对HepG2具有直接作用。PvEXP100-F1使巨噬细胞激活并向M1型极化,使MAPK信号通路被激活,刺激巨噬细胞分泌NO和炎性细胞因子IL-2、TNF-α。PvEXP100-F1对HepG2有直接抑制增殖和迁移的作用并调控其相关周期蛋白。因此,PvEXP100-F1在肿瘤的免疫治疗方面具有潜在应用价值,值得进一步研究。