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背景：
肝纤维化是对慢性肝脏损伤修复的瘢痕反应，其实质为持续的肝实质细胞损伤和(或)炎症反应，主要表现细胞外基质的合成与降解失衡，导致细胞外基质的大量沉积，从而导致纤维化的形成。既往研究发现早期控制病因可逆转肝纤维化、延缓疾病向肝硬化、肝癌方向进展，从而提高患者生活质量，减少病死率。关于肝纤维化发生、发展机制的研究，一直是国内外研究的重点及难点。目前临床上仍无有效抗肝纤维化治疗药物。肝细胞是肝脏中数量最多的肝实质细胞。肝脏损伤过程中，最先累及肝细胞，肝细胞受损后，分泌相关炎性因子，启动炎症反应，激活肝星状细胞等肌成纤维细胞，导致胶原沉积，最终纤维化形成。因此，减轻肝细胞损伤为缓解肝纤维化的重要途径。
细胞衰老是近年来研究的热点，细胞衰老是指细胞在多种因素刺激下，脱离细胞周期，并不可逆的丧失增殖能力的过程。细胞衰老是生物体衰老的基本单位，是人类老年相关性疾病的基础，它主要可以分为复制性衰老和早熟衰老(早衰)。其中，应激诱导的早衰(SIPS)是由于各种刺激因素引起的细胞生长停滞状态，与肝纤维化的发病机制有关。有研究发现细胞衰老发生于病毒、酒精、遗传、代谢等多种因素引起的慢性肝病中。既往我们研究发现，在CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型中，出现肝细胞衰老，在此基础上对其行慢性心理应激后，肝细胞衰老增加并加速肝纤维化的进展。
Progerin是一种永久性的法尼基化突变的核纤层A抗原蛋白，它可能会导致肝细胞早衰，从而影响肝脏疾病。既往研究表明，激活胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号通路可延长细胞寿命，减轻肝脏纤维化。然而，肝纤维化过程中肝细胞早衰的潜在机制以及IGF-1如何调控细胞早衰和纤维化，目前尚不清楚。
目的：
探讨肝纤维化形成过程中肝细胞早衰的潜在机制以及IGF-1如何调控细胞早衰和纤维化。
材料和方法：
1.CCl4诱导肝纤维化大鼠模型的建立：雄性SD大鼠(180-220g)按2ml/kg体重分别给予腹腔注射40%四氯化碳(CCl4)-橄榄油溶液，每周2次，共28天。在第0、3、6、14、28天，随机处死CCl4诱导的大鼠3只。通过病理分析评价肝纤维化程度，下腔静脉采血检测肝功能、血浆IGF-1水平；并检测肝组织p53和progerin的表达及SABG(衰老相关β-半乳糖苷酶)水平。分离各组大鼠原代肝细胞，检测肝细胞H2O2的含量、肝细胞中progerin、LaminA/C、p53蛋白表达。
2.IGF-1慢病毒载体转染大鼠模型：为探索IGF-1在肝纤维化中的作用，在SD大鼠腹腔注射CCl4-橄榄油溶液前1周，预先应用汉恒生物公司制备的GFP标记的IGF-1慢病毒载体和GFP-标记的空病毒载体，通过尾静脉注射1011病毒量转染至大鼠。即该实验分为四组：对照组(腹腔注射等量橄榄油，每组各6只，于第6天和28天处理)、CCl4模型组(腹腔注射40%CCl4-橄榄油溶液，每组各6只，于第6天和28天处理)、CCl4+LV-IGF-1组(转染IGF-1过表达慢病毒后腹腔注射40%CCl4-橄榄油溶液，每组各6只，于第6天和28天处理)和CCl4+LV-CTR组(转染空载体后腹腔注射40%CCl4-橄榄油溶液，每组各6只，于第6天和28天处理)。通过病理分析评价肝纤维化程度，下腔静脉采血检测肝功能、血浆IGF-1水平；并检测肝组织p53和progerin的表达及SABG(衰老相关β-半乳糖苷酶)水平。分离各组大鼠原代肝细胞，检测肝细胞H2O2的含量、肝细胞中progerin、LaminA/C、p53蛋白表达。
结果：
1.CCl4诱导的肝纤维化过程中，氧化应激增加伴随肝细胞衰老，同时伴随血浆IGF-1的降低
Masson染色和SA-β-gal染色及相对应区域面积显示，随着造模时间的延长，CCl4在诱导大鼠第6天和28天时分别引起脂肪性肝炎和早期肝纤维化阶段；同时，肝内细胞衰老明显增强。此外，在CCl4诱导的大鼠原肝代细胞中，随着H2O2含量的时间依赖性增加，p53和p21高表达，同时伴随原代大鼠肝细胞中progerin和LaminA/C蛋白水平不断上调，这提示在CCl4诱导的急、慢性肝损伤中肝细胞出现早衰。然而，在大鼠模型中，血浆IGF-1含量整体呈时间依赖性下调。
2.过表达IGF-1可缓解肝细胞早衰和肝纤维化
为探索IGF-1对肝细胞早衰和肝纤维化的影响，我们将IGF-1基因转入CCl4诱导的大鼠模型中过表达IGF-1。结果显示，与CCl4组和CCl4+LV-CTR组相比，CCl4+LV-IGF-1组在第6天和第28天的血浆IGF-1水平显著升高。同时，IGF-1过表达慢病毒载体的大鼠在第6天和第28天的血清ALT的含量较同期对照明显下降，差异具有统计学意义，这表明体内IGF-1过表达可改善肝功能，减轻肝损伤。
在造模第6天和第28天大鼠，空白对照组大鼠肝组织未见SABG的表达，CCl4组和CCl4+LV-CTR组大鼠，肝组织SABG表达明显增多。CCl4+LV-IGF-1组与CCl4+LV-CTR组相比，肝组织SABG表达明显减少。
在造模第6天和第28天大鼠，空白对照组大鼠肝组织未见p53、progerin的表达；相反，CCl4组和CCl4+LV-CTR组大鼠，肝组织p53、progerin表达增多，且主要表达于核内。CCl4+LV-IGF-1组与CCl4+LV-CTR组相比，肝组织p53、progerin表达明显减少，这提示IGF-1基因过表达，可以改善和缓解肝细胞早衰和肝纤维化。
3.过表达IGF-1通过调节核内p53/progerin通路缓解肝细胞早衰
为了描述在CCl4诱导的肝脏脂肪变性和肝纤维化中肝细胞对IGF-1过表达的反应，我们检测了从大鼠模型肝脏中分离的纯化原代肝细胞中的氧化和衰老相关标志物。结果显示，在造模第6天和第28天时，与CCl4组和CCl4+LV-CTR组相比，IGF-1慢病毒载体处理模型肝细胞H2O2含量降低，说明IGF-1过表达抑制了CCl4诱导的肝细胞的氧化应激。此外，在诱导第6天和28天的大鼠原代肝细胞中，与CCl4组和CCl4+LV-CTR组相比，CCl4+LV-IGF-1组肝细胞早衰相关蛋白progerin、LaminA/C和p53的蛋白表达明显下调。免疫荧光显示：在造模第6天和28天的大鼠中，与空白对照组相比，CCl4组和CCl4+LV-CTR组肝细胞progerin在核内高表达；CCl4+LV-IGF-1组肝细胞中progerin核内表达明显减少。这提示IGF-1过表达可能通过抑制核内p53/progerin通路减轻肝细胞早衰，从而缓解肝纤维化。
结论：
(1)在CCl4诱导肝脏脂肪变性和肝纤维化过程中，氧化应激水平增加，体内IGF-1减少，启动了p53介导的肝细胞早衰。(2)通过体内过表达IGF-1，CCl4诱导的氧化应激所触发的肝细胞早衰得到改善，而且肝脂肪变和肝纤维化得到缓解。(3)过表达IGF-1可通过调节核内p53/progerin通路，以缓解肝细胞早衰和改善肝纤维化。
肝纤维化是对慢性肝脏损伤修复的瘢痕反应，其实质为持续的肝实质细胞损伤和(或)炎症反应，主要表现细胞外基质的合成与降解失衡，导致细胞外基质的大量沉积，从而导致纤维化的形成。既往研究发现早期控制病因可逆转肝纤维化、延缓疾病向肝硬化、肝癌方向进展，从而提高患者生活质量，减少病死率。关于肝纤维化发生、发展机制的研究，一直是国内外研究的重点及难点。目前临床上仍无有效抗肝纤维化治疗药物。肝细胞是肝脏中数量最多的肝实质细胞。肝脏损伤过程中，最先累及肝细胞，肝细胞受损后，分泌相关炎性因子，启动炎症反应，激活肝星状细胞等肌成纤维细胞，导致胶原沉积，最终纤维化形成。因此，减轻肝细胞损伤为缓解肝纤维化的重要途径。
细胞衰老是近年来研究的热点，细胞衰老是指细胞在多种因素刺激下，脱离细胞周期，并不可逆的丧失增殖能力的过程。细胞衰老是生物体衰老的基本单位，是人类老年相关性疾病的基础，它主要可以分为复制性衰老和早熟衰老(早衰)。其中，应激诱导的早衰(SIPS)是由于各种刺激因素引起的细胞生长停滞状态，与肝纤维化的发病机制有关。有研究发现细胞衰老发生于病毒、酒精、遗传、代谢等多种因素引起的慢性肝病中。既往我们研究发现，在CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型中，出现肝细胞衰老，在此基础上对其行慢性心理应激后，肝细胞衰老增加并加速肝纤维化的进展。
Progerin是一种永久性的法尼基化突变的核纤层A抗原蛋白，它可能会导致肝细胞早衰，从而影响肝脏疾病。既往研究表明，激活胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号通路可延长细胞寿命，减轻肝脏纤维化。然而，肝纤维化过程中肝细胞早衰的潜在机制以及IGF-1如何调控细胞早衰和纤维化，目前尚不清楚。
目的：
探讨肝纤维化形成过程中肝细胞早衰的潜在机制以及IGF-1如何调控细胞早衰和纤维化。
材料和方法：
1.CCl4诱导肝纤维化大鼠模型的建立：雄性SD大鼠(180-220g)按2ml/kg体重分别给予腹腔注射40%四氯化碳(CCl4)-橄榄油溶液，每周2次，共28天。在第0、3、6、14、28天，随机处死CCl4诱导的大鼠3只。通过病理分析评价肝纤维化程度，下腔静脉采血检测肝功能、血浆IGF-1水平；并检测肝组织p53和progerin的表达及SABG(衰老相关β-半乳糖苷酶)水平。分离各组大鼠原代肝细胞，检测肝细胞H2O2的含量、肝细胞中progerin、LaminA/C、p53蛋白表达。
2.IGF-1慢病毒载体转染大鼠模型：为探索IGF-1在肝纤维化中的作用，在SD大鼠腹腔注射CCl4-橄榄油溶液前1周，预先应用汉恒生物公司制备的GFP标记的IGF-1慢病毒载体和GFP-标记的空病毒载体，通过尾静脉注射1011病毒量转染至大鼠。即该实验分为四组：对照组(腹腔注射等量橄榄油，每组各6只，于第6天和28天处理)、CCl4模型组(腹腔注射40%CCl4-橄榄油溶液，每组各6只，于第6天和28天处理)、CCl4+LV-IGF-1组(转染IGF-1过表达慢病毒后腹腔注射40%CCl4-橄榄油溶液，每组各6只，于第6天和28天处理)和CCl4+LV-CTR组(转染空载体后腹腔注射40%CCl4-橄榄油溶液，每组各6只，于第6天和28天处理)。通过病理分析评价肝纤维化程度，下腔静脉采血检测肝功能、血浆IGF-1水平；并检测肝组织p53和progerin的表达及SABG(衰老相关β-半乳糖苷酶)水平。分离各组大鼠原代肝细胞，检测肝细胞H2O2的含量、肝细胞中progerin、LaminA/C、p53蛋白表达。
结果：
1.CCl4诱导的肝纤维化过程中，氧化应激增加伴随肝细胞衰老，同时伴随血浆IGF-1的降低
Masson染色和SA-β-gal染色及相对应区域面积显示，随着造模时间的延长，CCl4在诱导大鼠第6天和28天时分别引起脂肪性肝炎和早期肝纤维化阶段；同时，肝内细胞衰老明显增强。此外，在CCl4诱导的大鼠原肝代细胞中，随着H2O2含量的时间依赖性增加，p53和p21高表达，同时伴随原代大鼠肝细胞中progerin和LaminA/C蛋白水平不断上调，这提示在CCl4诱导的急、慢性肝损伤中肝细胞出现早衰。然而，在大鼠模型中，血浆IGF-1含量整体呈时间依赖性下调。
2.过表达IGF-1可缓解肝细胞早衰和肝纤维化
为探索IGF-1对肝细胞早衰和肝纤维化的影响，我们将IGF-1基因转入CCl4诱导的大鼠模型中过表达IGF-1。结果显示，与CCl4组和CCl4+LV-CTR组相比，CCl4+LV-IGF-1组在第6天和第28天的血浆IGF-1水平显著升高。同时，IGF-1过表达慢病毒载体的大鼠在第6天和第28天的血清ALT的含量较同期对照明显下降，差异具有统计学意义，这表明体内IGF-1过表达可改善肝功能，减轻肝损伤。
在造模第6天和第28天大鼠，空白对照组大鼠肝组织未见SABG的表达，CCl4组和CCl4+LV-CTR组大鼠，肝组织SABG表达明显增多。CCl4+LV-IGF-1组与CCl4+LV-CTR组相比，肝组织SABG表达明显减少。
在造模第6天和第28天大鼠，空白对照组大鼠肝组织未见p53、progerin的表达；相反，CCl4组和CCl4+LV-CTR组大鼠，肝组织p53、progerin表达增多，且主要表达于核内。CCl4+LV-IGF-1组与CCl4+LV-CTR组相比，肝组织p53、progerin表达明显减少，这提示IGF-1基因过表达，可以改善和缓解肝细胞早衰和肝纤维化。
3.过表达IGF-1通过调节核内p53/progerin通路缓解肝细胞早衰
为了描述在CCl4诱导的肝脏脂肪变性和肝纤维化中肝细胞对IGF-1过表达的反应，我们检测了从大鼠模型肝脏中分离的纯化原代肝细胞中的氧化和衰老相关标志物。结果显示，在造模第6天和第28天时，与CCl4组和CCl4+LV-CTR组相比，IGF-1慢病毒载体处理模型肝细胞H2O2含量降低，说明IGF-1过表达抑制了CCl4诱导的肝细胞的氧化应激。此外，在诱导第6天和28天的大鼠原代肝细胞中，与CCl4组和CCl4+LV-CTR组相比，CCl4+LV-IGF-1组肝细胞早衰相关蛋白progerin、LaminA/C和p53的蛋白表达明显下调。免疫荧光显示：在造模第6天和28天的大鼠中，与空白对照组相比，CCl4组和CCl4+LV-CTR组肝细胞progerin在核内高表达；CCl4+LV-IGF-1组肝细胞中progerin核内表达明显减少。这提示IGF-1过表达可能通过抑制核内p53/progerin通路减轻肝细胞早衰，从而缓解肝纤维化。
结论：
(1)在CCl4诱导肝脏脂肪变性和肝纤维化过程中，氧化应激水平增加，体内IGF-1减少，启动了p53介导的肝细胞早衰。(2)通过体内过表达IGF-1，CCl4诱导的氧化应激所触发的肝细胞早衰得到改善，而且肝脂肪变和肝纤维化得到缓解。(3)过表达IGF-1可通过调节核内p53/progerin通路，以缓解肝细胞早衰和改善肝纤维化。