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辣椒(Capsicum spp.)是一种重要的蔬菜和加工调味品。雄性不育系的利用是进行辣椒优势育种的重要途径。花粉败育是植物雄性不育发生的表型体现，对花粉发育相关基因的研究不仅可以了解花粉发育的分子机制，还可以为人工创制雄性不育提供理论基础。本研究以辣椒(Capsicum annuum L.)隐性核雄性不育两用系AB114为材料，克隆了两个花粉发育相关候选基因CaMF1和CaMF2的全长序列，并分析了它们的表达模式，同时利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步分析了CaMF2在花粉发育中的功能。利用新一代转录组测序技术(RNA-Sequencing，RNA-Seq)系统分析了辣椒隐性核雄性不育两用系AB114花蕾的表达谱，筛选出大量辣椒花粉发育相关候选基因。通过电子克隆和RACE技术克隆得到了多个基因的全长序列，分析了它们的表达模式，为进一步揭示花粉发育的分子机理奠定了基础。获得的主要研究结果如下： (1)采用RACE技术从辣椒可育株中成功克隆到花粉发育相关基因CaMF1(Genbank登录号：HQ386720)。序列分析表明该基因DNA全长序列1854bp，没有内含子，最大开放阅读框1707bp，编码568个氨基酸，包含一个N端的乙二醛氧化酶保守域和一个C端的DUF1929保守域。同源性比对发现CaMF1序列与一些乙二醛氧化酶相关蛋白有50～78％的相似性。RT-PCR和qRT-PCR分析表明该基因在可育株的3～7级花蕾中表达，在第4级花蕾达到表达高峰，随后下降。对不同器官的表达分析表明，CaMF1仅在可育株花药中表达，在根、茎、叶、花萼、花瓣、雌蕊以及不育株的所有相应组织中均没有表达，推测CaMF1是一个与花粉发育密切相关的花药特异表达基因。 (2)采用RACE技术从辣椒可育株中克隆到花粉发育相关基因CaMF2(Genbank登录号：JF411954)。该基因DNA全长序列为829bp，包含两个外显子(348bp，338bp)和一个230bp的内含子，最大开放阅读框285bp，编码94个氨基酸。推导的氨基酸具有一个含8个半胱氨酸的基序和一个AAI_LTSS保守域。BLAST同源性比对发现CaMF2与一系列花药特异表达LTP假定蛋白有较高的相似性，且具有LTP的典型结构特征。RT-PCR和qRT-PCR对其时空表达模式分析表明该基因是一个花药特异基因，在可育株的3～7级花蕾中表达，在第4级花蕾有一个表达高峰，而在不育株的相应组织中不表达。 (3)构建了一个CaMF2烟草脆裂病毒(TRV)重组质粒，采用VIGS方法特异地抑制目标基因在辣椒可育植株中的表达。结果表明，相应的mRNA水平在CaMF2沉默植株花蕾中比对照(pTRV2)减少90%。相对于野生型和空载体对照植株(pTRV2)，CaMF2沉默植株的花药开裂推迟，花药中的花粉减少。体外条件下花粉萌发实验结果表明，沉默植株的花粉萌发率是32.63%，而野生型是68.80%，空载体对照植株是65.41%。而且，沉默植株的花粉管要比野生型和对照植株短。电镜扫描观察发现，相对于野生型和对照植株，沉默植株大量花粉萌发沟的数目及分布不规则，部分花粉深内陷。统计结果表明，在CaMF2沉默植株中有45.42%花粉为畸形，而在野生型和对照植株(pTRV2)分别是5.83%和6.48%。说明抑制CaMF2的表达能够降低花粉的萌发率和导致花粉畸形，推测CaMF2在辣椒花粉发育中起着一定的作用。 (4)利用RNA-Seq技术比较分析了辣椒核雄性不育两用系蕾期基因表达谱。在可育株和不育株花蕾中得到总clean reads数分别为6176119条和6029398条，平均长度为49nt。与参考基因比对上的总reads数分别为4320312条(69.95%)和4399120条(72.96%)。在可育株和不育株中共筛选出668个差异表达基因，其中562个在可育株中上调表达，106个在可育株中下调表达。在上调基因中，有202个基因只在可育株中检测到，推测可能与花粉发育相关。而在106个在不育株中上调表达的基因中，只有2个基因在不育株中特异表达。通过同源比对发现在可育株特异表达的202个基因中有141个基因被NCBI上的基因注释，其中49个基因为未知蛋白或假定蛋白。其余的61个基因则完全找不到同源基因，可能是花粉发育相关新基因。被注释的基因主要包括花粉外壁蛋白，油脂结合蛋白，脂质转移蛋白，果胶甲酯酶，雄性不育相关蛋白，花药特异蛋白，果胶裂解酶基因等。 (5)对可育株中上调表达的前353个基因进行了Gene Ontology功能分类和Pathway显著性富集分析。利用RT-PCR技术验证了RNA-Seq的结果，在被验证的前100个差异片断中，有84个再次被证明在可育株花蕾中特异表达，阳性率高达84%，在剩下的16个基因中，有10个基因在可育株中优势表达，其余6个基因在两个模板中都没有扩增出条带。采用RT-PCR方法初步分析了48个可育株特异表达基因在不同花蕾发育时期的表达模式。结果表明有27个基因在花粉发育的晚期表达，21个基因在花粉发育的早期表达。 (6)采用电子克隆和(或)RACE技术得到了FB13，FB20，FB53，FB62，FB76的cDNA和DNA全长序列以及FB21和FBIOO的cDNA全长序列。这些基因包括查耳酮合成酶、雄性不育相关蛋白、乙醇脱氢酶、减数分裂丝氨酸蛋白酶基因等。RT-PCR和qRT-PCR结果表明：这7个基因均在可育株花粉发育的早期开始表达(3～6级花蕾)，且都为花药特异基因，在不育株所有检测组织中均不表达。说明这些基因可能在花粉或花药发育的前期或中期起着一定的作用，有可能通过影响花粉母细胞减数分裂或绒毡层的发育而进一步影响花粉发育。 (7)采用电子克隆和(或)RACE技术扩增得到了FB6，FB9，FB74，FB50，FB81，FB95的cDNA和DNA全长序列以及FB18和FB67的cDNA全长序列。这些基因包括晚期胚胎富集蛋白，花粉外壁蛋白，果胶裂解酶，果胶甲脂酶基因等。RT-PCR和qRT-PCR结果表明：这8个基因均为花药特异基因，主要在花粉发育的第7～8时期和开放花中表达；有的在第8时期出现表达高峰，有的在开放花中表达最为强烈，而在不育株相应组织中均不表达。推测这些基因可能在花粉的成熟和花粉萌发中起着一定的作用。