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研究背景丙型病毒性肝炎是由丙型病毒性肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)感染所致,是一种属于黄病毒科的小型RNA病毒。美国科学家于1989年克隆出丙型病毒性肝炎病毒基因。HCV主要经输血、针刺、吸毒及母婴等途径传播。据世界卫生组织统计,全球约有1.8亿人感染HCV,感染率约为3%,每年约3.5万例新发病例。目前,HCV已呈全球性流行趋势,不仅可导致慢性肝炎和肝纤维化,进展为肝硬化,其中,约有3-10%病例还可发展为肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)。由此可见,丙型病毒性肝炎已成为严重威胁人类健康的重要疾病之一,是值得进行深入研究。目前,丙型病毒性肝炎的临床诊断以病毒血清学检测为主、病理诊断为辅。光学显微镜下仅能通过小叶内及汇管区的炎症程度进行诊断,这些表现早期往往并不明显。电子显微镜下对细胞超微结构的观察并归纳总结成为了病理诊断的主要突破点,不仅能通过细胞超微结构的改变进行早期病理诊断,还能推测疾病的发生发展和预后。然而,目前对丙型病毒性肝炎的超微结构研究还很少。我们现对丙型病毒性肝炎的常规病理及超微结构进行研究,并在超微结构的水平上观察其各期的特点,为丙型病毒性肝炎超微结构的深入研究增添基础,为其临床分期和治疗增添超微病理依据。研究目的本研究对不同炎症程度的丙型病毒性肝炎患者肝脏组织进行苏木素-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色及特殊染色,根据病理改变进行病理分期评估。同时,观察不同炎症程度的丙型病毒性肝炎患者的肝细胞超微结构,探讨不同炎症程度丙型病毒性肝炎以及癌变的肝细胞超微结构特征与病情严重程度的关系,进而预测丙型病毒性肝炎的发展和预后。研究方法1、研究对象:收集联勤保障部队第900医院2011年8月至2017年8月病毒血清学检测HCV抗体阳性病例,共120例,其中4例在3年随访后发展为HCC,行经皮肝脏活检穿刺收集患者肝脏组织标本;另随机收集20例肝血管瘤周围肝脏组织标本作为阴性对照。2、资料采集及处理:收集上述病例的基本信息及临床病理资料,包括患者性别、年龄、病毒血清学检测病毒感染情况、是否为首次发作、肝纤维化评估、术后治疗方案及预后情况的随访工作。HE染色、胶原纤维染色和网状纤维染色后,在光学显微镜下进行组织形态学观察,按照改良Scheuer组织学评分系统进行分级分期。3、在光学显微镜诊断基础上利用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM),利用从石蜡组织块中抠取的肝穿刺组织,从制备方法上通过对传统二甲苯脱蜡方法的的改良,利用汽油脱蜡法进行透射电镜基础制样,观察不同炎症程度的丙型病毒性肝炎及癌变标本的超微结构特点,并对其归纳总结。结果1、光镜下观察结果:120例慢性丙型病毒性肝炎病例中,包括56例轻度慢性丙型病毒性肝炎、45例中度慢性丙型病毒性肝炎和19例重度慢性丙型病毒性肝炎。轻度慢性丙型病毒性肝炎镜下可见肝细胞水肿变性,肝细胞核糖原化,偶见点状坏死;轻微汇管区炎症,可见滤泡形成,汇管区无纤维化或少量纤维组织增生。中度慢性丙型病毒性肝炎镜下可见肝细胞水肿变性,点状坏死,界面炎;汇管区炎症,纤维组织增生,可伴纤维间隔形成。重度慢性丙型病毒性肝炎镜下可见肝细胞点状坏死明显,界面炎显著;汇管区炎伴显著淋巴滤泡形成;纤维组织增生、桥接或弓形纤维形成,早期假小叶形成。2、从石蜡包埋块中取材,经汽油改良脱蜡法后,上镜观察发现包埋块硬度适中,浸透效果理想,制片过程顺畅,染色对比度反差明显,肝组织超微结构清晰可辨,细胞内部结构及各细胞器的保存完整,电镜观察效果满意。3、电镜下观察结果:56例轻度慢性丙型病毒性肝炎病例中,14例可见肝细胞胞浆内糖原增多、聚集分布;有20例较正常肝细胞中可见胞浆内粗面内质网的减少、滑面内质网的增多。45例中度慢性丙型病毒性肝炎中,10例可见胞浆内脂滴增多,大脂滴形成,38例细胞间可见细胞间胶原纤维增多。19例重度慢性丙型病毒性肝炎中12例出现线粒体变形,脂滴显著增多,细胞间胶原纤维显著增多,其中3例表现为部分线粒体肥大,线粒体嵴断裂,粗面内质网扩张。4例癌变病例:内质网明显囊性扩张,线粒体减少,线粒体空泡变。结果表明,糖原增多、粗面内质网减少、线粒体融合、脂滴增多、细胞间胶原纤维、粗面内质网扩张与丙型病毒性肝炎病变程度之间具有统计学相关性(P<0.05)。结论1、我们改进传统二甲苯脱蜡方法,采用汽油进行脱蜡,经电镜观察发现改良法脱蜡更为充分,所得超薄切片更为完整,改良法能够有效利用石蜡包埋组织,肝细胞中细胞器超微结构保存完整,形态清晰可辨,染色效果理想,扩大了电镜标本的处理范围,为相同标本的光镜和电镜诊断之间建立了相互沟通的桥梁,避免了由于需要电镜诊断而不得不进行二次临床取材的困扰。改良法节省制样的时间,大幅提高了制片效率,保证观察效果,提高阅片速度和诊断准确率,对操作者伤害较小,且利于环保,值得推广使用。2、在TEM下观察,慢性丙型病毒性肝炎的肝细胞超微结构会伴随炎症及纤维化程度的不同而发生一系列改变。不同炎症程度的丙型病毒性肝炎肝细胞的某些超微结构会出现相应地特征性的变化。3、通过观察丙型病毒性肝炎的某些超微结构的特征性变化,对协助临床病例分级分期和预测其发展趋势具有一定的意义。