论文部分内容阅读
FBXL亚家族是F-box蛋白中的一个大家族，研究表明FBXL亚家族的不同成员参与经历了蛋白泛素化蛋白水解途径，对植物生长发育及生物和非生物胁迫响应发挥着重要作用。CsFBXL是FBXL亚家族中的一员，经初步的研究结果表明该CsFBXL的转录表达可能受激素和盐胁迫等因素的影响，对这些因素的诱导有不同程度的应答，但对这些诱导机制还不清楚。所以为了进一步的研究CsFBXL基因受逆境胁迫诱导机制，本研究从黄瓜基因组DNA中成功克隆分离出CsFBXL基因相应的启动子序列，并且利用农杆菌介导烟草叶片瞬时表达系统，通过缺失体进一步分析CsFBXL对不同逆境胁迫应答和可能的顺式作用元件。 随着黄瓜生长发育分子生物学机制的研究深入，对于基因表达的探索也由定性分析阶段发展到定量分析阶段。基因表达模式检测都倾向 qRT-PCR应用技术检测，为获取精确的qRT-PCR实验结果，选适合的内参基因很关键。但是内参基因在不同的植物和不同的实验处理等条件下的表达都不是恒定的。因此，使用 qRT-PCR前，需对内参基因进行表达稳定的验证评估。 主要研究结果如下： 1.根据已测序完成的黄瓜基因组序列和CsFBXL基因序列，使用DNMAN软件分析，预测启动子序列。采用PCR技术获得CsFBXL基因上游的启动子全长序列2.2kb。 2.通过使用plantCARE等数据库分析分离启动子元件，结果显示，该启动子含有TATA-box和CAAT-box等核心启动子区域，且TATA-box位于转录起始位点的上游-30bp处，符合真核基因启动子的特点。同时该启动子还含有AE-box、ARE、CGTCA-motif、P-box、SARE等元件。 3.为进一步分析上述启动子元件作用机制，使用不同片段长度的启动子片段区域（232bp、551bp、849bp、1518bp、2.2kb）分别替代Pcambia1301表达载体上的CaMV35S，构建不同 长度片段的表达载体，分别为 CsFBXLp232、CsFBXLp551、CsFBXLp849、CsFBXLp1518和CsFBXLp2200。 4.使用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达系统结果显示：启动子全长区域片段在SA和MeJA诱导下可强烈激活诱导报告基因GUS基因；同时存在SA(TCA-element)和MeJA(CGTCA-motif)元件的区域片段在SA和MeJA的诱导下可强烈诱导GUS基因表达；启动子全长序列存在干旱元件MBS时，在PEG-6000和NaCL处理下可诱导GUS基因表达，当缺失干旱元件MBS时，则其GUS活性不表达；启动子全长序列在低温诱导时，则不足于诱导GUS表达或表达较弱，而在缺失了SA元件和其他一些元件时，位于上游-534bp的干旱元件LTR反而诱导了GUS报告基因；启动子全长区域在高温诱导下，不足于诱导GUS的表达，当缺失了其他元件只有MeJA(CGTCA-motif)存在时，反而诱导了GUS表达，这与MeJA可延缓高温胁迫。 5. geNorm-M软件分析，在根样品中，EF1a-1、ACT和UB1-ep是最合适的内参基因；在叶片样品中，TUA-1、TUA和ACT3是合适的内参基因；在果实样品中分析显示，UBQ、UB1-ep和ACT2是最合适的内参基因；在种子样品中分析显示，TUA-1、UBQ和ACT3是最合适的内参基因。 6. NormFinder软件分析，UB1-ep、ACT3和TUA-1分别是根、茎和叶片样品的最合适的内参基因；TUA-1、ACT3和EF1a-1分别是花、果实和种子样品的最合适的内参基因。 7.Stabillty Index软件分析，ACT1是整个生长发育期最合适的内参基因。