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氨基酸（amino acid）作为生物功能大分子蛋白质的基本组成单位和植物体中重要的氮代谢物，能对大气氮沉降良好响应，还能对环境胁迫如:水压力、盐分、高温、寒冷、营养供给不平衡、重金属、病虫害、大气污染、紫外照射响应。探索氨基酸氮同位素(δ15N)的分析测试方法，能够为植物中氮代谢循环和用植物中游离氨基酸指示环境氮源开辟一片新的天地，从而使该领域的研究向前推进一步。本文初步建立了20种氨基酸的氮同位素的测试分析方法，为深入研究和探讨植物中游离氨基酸对环境氮的响应提供了技术支持。 研究工作围绕以下四个方面的内容展开:首先是总结了植物中游离氨基酸的研究进展，详细摘录了植物组织中游离氨基酸的代谢机制以及游离氨基酸对环境氮和环境胁迫的响应;其次是对比了国内外游离氨基酸的提取纯化方法，衍生方法，并从中获取适于气相色谱/燃烧/同位素比值质谱(GC/Isolink/MAT253)的样品提取、富集和衍生技术。并以此为基础建立氨基酸含量的GC-FID测定方法和氨基酸氮同位素的GC/Isolink/MAT253测定方法;第三是对比了4种固相萃取小柱对松针游离氨基酸粗提液的纯化效果，从4种小柱中选择了对游离氨基酸有最佳纯化效果的小柱并优化了小柱的洗脱条件。第四是分析了贵阳市和贵阳周边雪松和马尾松针叶中游离氨基酸的氮含量和氮同位素。在方法的建立的分析过程中主要获得了如下成果: 1.建立了20种游离氨基酸含量的测定方法 本文建立了应用气相色谱-火焰离子化检测器(GC-FID)测定游离氨基酸含量的方法。GC-FID色谱条件为:色谱柱为DB-5MS(30m0.25 mm0.25μm);载气:氦气;恒流模式:流速1.2ml/min;进样口温度280℃;采用三阶段程序升温，具体设置如下:90℃保留1分钟，8℃/min升到140℃，保留5min，3℃/min升到220℃，12℃/min升到285℃保持12.5min。 配制4种浓度梯度（0.3mmol/L，1.5mmol/L，3mmol/L，4.5mmol/L）的氨基酸混合标准衍生后，按上述色谱条件进行测定，以氨基酸标样浓度为横坐标(X)，以峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，进行线性回归得到回归方程。结果表明，各氨基酸的相关系数在0.992～0.999，即在0.3～4.5mmol/L的线性范围内氨基酸峰面积与其质量浓度呈良好的线性关系，表明该方法能用于测定浓度在0.3～4.5mmol/L范围内氨基酸的质量浓度。 2.建立了用GC/Isolink/MAT253测定20种氨基酸氮同位素值的方法 本研究用硅烷化衍生方法GC/Isolink/MAT253测定了浓度变化范围在0.3～4.5nmol内的20种氨基酸混合标准样品tBDMSi衍生物的δ15N值。GC的色谱条件与GC-FID色谱条件一致。样品通过色谱柱DB-5MS分离后，由燃烧炉(GC-Isolink)氧化还原后，燃烧产生的水分由全氟磺酸渗透膜去除，CO2由液氮冷阱去除。N2通过分流设备进入同位素比值质谱。由万能接口(ThermoConfloⅣ interface)进入质谱测定。燃烧炉温度为1000℃。同位素比值质谱加速电压为10kv，离子电流通过用3个法拉第杯m/z28，29，30检测。 3nmol20种氨基酸混合标准样品tBDMSi衍生物氮同位素标准偏差在0.3‰和0.7‰之间，平均标准偏差为0.5‰。浓度变化范围在0.3～4.5nmol内20种氨基酸氮同位素值精度在0.3～0.8‰之间，平均标准偏差为0.5‰。 3.建立了用GC/Isolink/MAT253测定20种氨基酸氮同位素值的校正方法 本研究将GC/Isolink/MAT253测得的20种氨基酸(tBDMS)衍生物的氮同位素平均值和EA/IRMS测定值进行对比，用于校正GC/Isolink/MAT253系统和硅烷化衍生反应也会造成氨基酸氮同位素的分馏。建立用GC/Isolink/MAT253测定氮同位素的校正方法。用GC/Isolink/MAT253测定3nmol氨基酸混标56次，采用分组校正的方法17种氮信号值未显著亏损的氨基酸衍生物(Ala，Gly,Gaba，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Ser, Thr, Phe，Asp，Glu，Lys，His，Tyr, Trp)的氮同位素测定值和真实值显著正相关(y=0.9319x-0.2926，R2=0.9973，p＜0.0001，n=56，x为氨基酸氮同位素真实值，y为氨基酸氮同位素的GC/Isolink/MAT253测定值)。3种存在氮信号值亏损的氨基酸衍生物的GC/Isolink/MAT253测定值和真实值也呈线性正相关关系(y=0.8721x+0.0914;R2=0.9991，p＜0.0001，n=56)。20种氨基酸通过分组后的校正方程校正后，GC/Isolink/MAT253测定值与真实值之差在0.12‰～0.64‰之间。用GC/Isolink/MAT253测定0.3～4.5nmol氨基酸混标45次，分组校正后GC/Isolink/MAT253测定值与真实值之差在0.02～0.48‰之间。可见采用分组校正的方法能在氨基酸含量在0.3～4.5nmol的范围内取得令人满意的准确度。 4.优化了松针中游离氨基酸的纯化方法 20种氨基酸用C18小柱纯化后，10％的乙醇对氨基酸的洗脱效果要好于20％酒精的洗脱效果，回收率在92％～119％之间。17中氮信号值未明显亏损的氨基酸用10％的乙醇洗脱的氮同位素值与未过柱的氨基酸氮同位素值相比存在0.60‰的分馏小于20％乙醇(0.94‰)。3种氮信号值明显亏损的氨基酸10％的乙醇洗脱产生的氮同位素分馏为0.38‰也小于20％的乙醇(0.45‰)。过柱后Ile，Pro，Gln的氮同位素值和未过柱的氨基酸的氮同位素值有显著性差异。 氨基酸混标通过SCX小柱纯化后，2mol/l氨水和5％氨水的回收率大致相同，分别是24％～101％和19％～99％。但是精氨酸，赖氨酸和组氨酸用该小柱不能取得满意的回收率不满足氮同位素测定的需要。SCX小柱用2mol/l氨水洗脱后氨基酸的氮同位素比未过柱氨基酸偏正0.63‰，而5％氨水洗脱造成的氮同位素分馏是1.16‰。Met，Pro，Gln氮同位素值过柱后与未过柱的氮同位素值有显著性差异。 氨基酸混标用氨基酸专用柱纯化20ml1 mol/l的氨水浓度洗脱的洗脱条件能回收20种氨基酸并获得令人满意的氨基酸回收率(96％～109％)满足氨基酸氮同位素测定的需要。过柱后氨基酸的氮同位素值与未过柱氨基酸相比有0.7‰的氮同位素分馏。Trp和Pro氮同位素值过柱后与未过柱前有显著性差异。 用DOWEX树脂纯化氨基酸的回收率在39％～120％之间，过柱后17种氮信号值未明显亏损的氨基酸氮同位素值相比过柱前偏正2.42‰。Arg，Gln，Asn这3中氮信号值有亏损的氨基酸过柱后的氮同位素值与未过柱氨基酸没有相关性。16种氨基酸的氮同位素值与未过柱的氮同位素值出现了显著性差异。 结合小柱对氨基酸回收率的影响和可能带来的同位素分馏以及对松针样品粗提液中杂质的去除效果，本研究认为用氨基酸专用柱纯化氨基酸，20ml1mol/l氨水作为洗脱条件能获得最好的氨基酸纯化效果。 5.用松针中的游离氨基酸含量示踪环境氮沉降量 贵阳市雪松针叶组织的总氮含量从贵阳市远郊到交通主干道增加，变化范围为1.6～2.7％。相应的针叶组织中的总游离氨酸含量也呈上升趋势，从郊区的484.5μg g-1增加到交通主干道的2449.6μg g-1。松针中的游离氨基酸含量的变化趋势与总氮一致并且总游离氨基酸含量的变化要大于植物总氮的变化。松针中的游离氨基酸对环境氮的响应比植物总氮更灵敏。 松针中氮含量增加到某个阈值(20 mg g-1)时，游离氨基酸的氮含量会显著增加，说明了此时植物组织中的氮代谢已经发生改变。环境氮含量的增加超过了针叶正常蛋白质合成的需要，开始用可溶性非蛋白（主要为可溶性氨基酸）储存和解毒多余氮。 贵阳市区雪松针叶中20种游离氨基酸的含量都随着组织总氮含量的增加而增加，20种游离氨基酸增加幅度并不相同造成每种氨基酸占总氨基酸的比例会发生变化。其中Pro,Arg增加的比例最多，而Glu占总氨基酸的比例减少最多。高剂量的氮的环境条件下，为了避免细胞毒性（氨的累积），吸收的含氮化合物必须通过形成C骨架少的氨基酸来解毒。松针会通过累积Pro，Arg来移除多余的氮对植物的毒性。 从贵阳市中心往东北方向还是西南方向马尾松总游离氨基酸的浓度随着离市中心的距离而降低后又略有上升。马尾松针叶组织中的游离氨基酸含量的空间分布与用苔藓组织氮含量分析的贵阳市区及其周边农村大气氮沉降空间分布一致表明游离氨基酸能对环境氮做出响应并且可以用于示踪环境氮沉降量。 6.用松针中的游离氨基酸氮同位素示踪环境氮源 市中心和交通干道上雪松针叶20种游离氨基酸加权平均氮同位素值偏正为5.25‰和5.58‰，与汽车尾气释放NOx的δ15N(+5.7±2.8‰)相接近，指示该地区的环境氮源主要是汽车尾气排放的NOx。雪松针叶Pro，Asn，Asp，Glu,lys，Gln，Arg氮同位素值在远郊相对于市中心和交通干道上偏负与总氮同位素的变化规律一致，为用这6种游离氨基酸的氮同位素值指示环境氮源提供了可能性。 贵阳市中心马尾松的针叶中游离氨基酸以Asn的氮同位素值最偏负为-3.90‰，Thr的氮同位素值最偏正为+22.86‰。而雪松针叶中游离氨基酸以Met的氮同位素值最偏负为-14.25‰，Gly的氮同位素值最偏正为18.15‰。但马尾松的针叶中游离氨基酸氮同位素的加权平均值为5.27‰和雪松针叶中游离氨基酸的加权平均值为5.25‰一致，表明这2种松树针叶的游离氨基酸氮同位素值加权平均值都能指示环境氮源，但是2者的氮代谢机制存在差异。 马尾松针叶中游离Pro，Asp，Glu，Asn，Arg和总氮的氮同位素值呈现从贵阳市区往农村逐渐降低的变化。贵阳市游离氨基酸氮同位素偏正是因为受到汽车尾气排放气态NOx的影响。而农村地区游离氨基酸的氮同位素值相对偏负与农业氨源的释放有关。