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目的: PAK(p21 activated kinase)为一类保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过其下游众多的激酶底物和结合蛋白参与众多的生物学功能，例如:细胞变形、运动、存活、基因转录和激素信号传导等[1-5]，目前被认为是肿瘤细胞信号网络的关键调节因子，最近报导PAKs还与神经系统疾病和感染性疾病有关[6]。迄今鉴定的PAK家族成员包括六个成员:PAK1-PAK6，根据结构相似性分为两类，Ⅰ类包括PAK1-3，Ⅱ类包括PAK4-6。两类PAK在结构上包括N末端保守的PBD结构域(p21 binding domain)和C末端保守的激酶域(kinase domain，KD)[7]。两类PAK结构上最大的差别是Ⅰ类PAK在N-末端含有一个与PBD部分重叠的自我抑制域(auto-inhibitory domain，AID)，而Ⅱ类PAK没有，因此二类PAK在活化方式及生物学功能上存在差异。 PAK4是Ⅱ类PAK中最早被鉴定的，也是Ⅱ类PAK中研究的最为广泛的成员，但是目前发现的PAK4相互作用蛋白仍然十分有限，对PAK4的研究仍处于起步阶段。因此我们利用酵母双杂交技术从人胎脑文库中筛选出若干PAK4相互作用蛋白，其中LMO2就是一个新的PAK4相互作用蛋白。为了探讨LMO2与PAK4的相互作用在PAK家族中是否具有特异性，我们采用TNT结合GSTpull-down实验将LMO2和PAK1/2/4/5/6分别作用，结果发现LMO2不仅能与PAK4，还能与PAK1/5结合，其中与PAK5的结合是最强的。鉴于LMO2是一个重要的转录辅因子[8]，PAK5又能够经过细胞外信号刺激实现‘核浆穿梭’，而且PAK5的核内功能一无所知[9]，所以我们将研究的重点转向了PAK5与LMO2相互作用所引起的生物学功能研究。 PAK5是最新发现，且研究最少的PAK家族成员。PAK5在神经组织中表达水平很高，其在细胞骨架调节方面具有重要作用。通过Cdc42/Rac通路，PAK5能促进N1E-115细胞神经轴突和丝状伪足的形成[10]。而且，PAK5同PAK1一样，在由鸟苷酸交换因子(GEFT)所引起的神经突向外生长和树突棘的形成过程中是必须的[11]。另外，MARK通过磷酸化微管相关蛋白Tau使其从微管上脱离下来，从而使微管解聚。而PAK5可以直接与MARK相互作用并使其失活，负向调节Tau的磷酸化，从而起到稳定微管的作用[12]。在神经细胞中，PAK5也可以通过磷酸化cofilin来调节肌动蛋白重组[13]。最近有报导称PAK5有通过调节结肠癌细胞黏附和迁移能力的变化，从而促进其运动的作用，但具体机制不详[14]。到目前为止，PAK5行使生物学功能的场所全部位于细胞浆内，核内功能一片空白，而PAK5在血清的刺激下是可以入核的，这提示PAK5可能存在一些不为人知的核内功能[9]。本研究就是重点论述PAK5入核后调节E-cadherin基因转录的功能。 LMO2(LIM domain Only protein2)于1991年发现，染色质异位或逆转录病毒插入都能导致LMO2基因非正常激活，导致急性T淋巴细胞白血病[15-17]。同时LMO2是一个重要的转录辅因子，它常与GATA1/E47/LDB1/TAL1形成转录复合体，参与多个基因的转录调控[18-22]。其中转录因子GATA1发挥了关键的作用，LMO2又常常能与其直接结合增强GATA1对某个基因的调节作用[23-25]。而我们发现PAK5又能与LMO2直接相互作用，提示PAK5也可能有基因转录调控的功能，这对于PAK5的研究是一个全新的领域。 早期发现GATA1与造血功能密切相关，其作为一个的转录激活子可促进红细胞分化成熟[26-28]。随着研究的深入，发现GATA1可参与调节众多基因的表达，其中多数调节是促进的，少数是抑制的[29-31]。作为一个重要的转录因子，GATA1可特异识别并结合基因启动子区上经典的(T/A) GATA(A/G)序列，后来发现GATA1还可结合非经典的GATT和CATC序列[32-34]。另外，GATA1常与转录因子E47通过LMO2、LDB1和TAL1的连接形成一个典型的转录复合体参与基因的转录调控，E47结合在E-box(CACCTG/CAGGTG)上，而GATA1就结合在附近的GATA框GATA/GATT/CATC上[35-37]。本研究中，我们发现并证实了GATA1可结合在E-cadherin启动子上的CATC(-344/-341)序列上，对其进行抑制调节。 E-cadherin是一种重要的细胞间黏附因子，其表达的缺少是发生上皮样向间质样分化(EMT)的标志，而EMT是上皮细胞发展成具有转移能力的癌细胞过程的早期病变事件[38-39]。因此，对E-cadherin的调节显得尤为重要。到目前为止，共有6到8个转录调节子参与调节E-cadherin基因转录和肿瘤EMT的发生，他们包括直接结合在E-cadherin启动子上的抑制子:SNAI1，SLUG，SIP1和E47，间接结合的有:TWIST1，FOXC2，FOXC1，GSC和ZEB1[40-43]。而在本研究中，我们又发现了一个新的能直接结合在E-cadherin启动子上的转录抑制子GATA1。他可通过招募HDAC3/4对染色质进行重塑，使E-cadherin基因发生去乙酰化，达到抑制其表达的效应。 去乙酰化(Deacetylation)，磷酸化(Phosphorylation)，类泛素化(SUMOylation)是蛋白质翻译后的三种修饰作用。其中磷酸化是一种蛋白激酶使其底物在特定氨基酸标记上磷酸基团的生化反应，与信号转导、细胞周期、基因转录等密切相关44];去乙酰化是在组蛋白去乙酰基酶(HDACs)的作用下使组蛋白发生去乙酰基的过程，它通常与基因的转录抑制有关[45];而类泛素化在调节蛋白质的稳定性和功能中起着关键的作用，包括调节蛋白相互作用、蛋白核浆转运、基因转录和拮抗泛素降解等，后者能使转录因子或辅因子稳定性提高，增强转录调节效应[46]。 本研究中，我们发现了一个新的PAK5相互作用蛋白LMO2，而且LMO2可以作为一个桥梁分子将PAK5和GATA1间接地连接起来，形成一个全新的转录复合体PAK5/LMO2/GATA1。而对于这一新的转录复合体是如何下调E-cadherin的表达的？我们也进行了较为深入的探讨。我们发现:一方面，PAK5通过LMO2可磷酸化GATA1，这将促进GATA1的类泛素化(SUMOylation)，提高GATA1的稳定性，使其免于泛素降解，而且SUMO化的GATA1能招募更多的HDAC3/4结合到E-cadherin启动子上，使其发生去乙酰化，从而抑制E-cadherin的表达;另一方面，PAK5还能促进GATA1蛋白的表达，我们猜测PAK5入核后可能会促进GATA1基因的转录和翻译，虽然我们在此没有深入研究。但是这将使活化的GATA1在细胞核内富集，促进其对E-cadherin的抑制作用。这可能会是新型转录复合体PAK5/LMO2/GATA1对E-cadherin基因转录翻译抑制的机制。 材料与方法: 一、转录复合体PAK5/LMO2/GATA1的形成 1、用酵母配合实验和GST-pull down实验证实PAK4与LMO2的相互作用。 2、用GST-pull down实验证实PAK4与LMO家族蛋白作用的特异性，反之证实LMO2对PAK家族蛋白作用的特异性。 3、用免疫共沉淀(Co-IP)的方法证实PAK5与LMO2的结合。 4、用胎牛血清(FBS)刺激，结合共焦激光扫描显微镜观察PAK5入核的时间点及其与LMO2在细胞核内的共定位。 5、用GST-pull down和免疫共沉淀（Co-IP）的方法证实PAK5参与转录复合体PAK5/LMO2/GATA1的形成。 6、用GST-pull down实验证实LMO2是连接PAK5和GATA1的桥梁分子，并且找到PAK5和GATA1分别结合到LMO2上的区域。 7、结合GST-pull down和免疫共沉淀（Co-IP）的结果，绘制转录复合体PAK5/LMO2/GATA1的转录模型。 二、转录复合体PAK5/LMO2/GATA1对E-cadherin基因的下调 1、用Western Blot方法检测PAK5、LMO2、GATA1、E-cadherin在几种乳腺相关细胞中的表达情况。 2、用Dual-Luciferase Reporter Assay System探讨转录复合体PAK5/LMO2/GATA1及其成员对E-cadherin基因的转录调节作用。 3、用Dual-Luciferase Reporter Assay System、免疫共沉淀(Co-IP)及免疫荧光(IF)结合共焦激光扫描显微镜的方法证实截掉出核信号(NES)的PAK5ΔNES(30～83，401～411aa)突变体能与LMO2结合并下调E-cadherin。 4、用Dual-Luciferase Reporter Assay System验证GATA1在三种不同细胞系中对E-cadherin基因都有下调作用。 5、用Western Blot检测不同剂量和不同时间点的GATA1表达对E-cadherin蛋白表达的影响。 6、用免疫荧光(IF)结合共焦激光扫描显微镜的方法检测GATA1对细胞连接的影响。 7、用RNA干扰结合Transwell小室的方法探讨沉默掉GATA1后对E-cadherin蛋白表达和细胞迁移力的影响。 8、用生物信息学的方法分析E-cadherin基因启动子区域的GATA1结合序列。 9、用Dual-Luciferase Reporter Assay System分析GATA1对不同E-cadherin基因启动子截短突变体的抑制作用，寻找并证实GATA1确切的结合位点。 10、用染色质免疫沉淀（ChIP）的方法证实GATA1能结合在E-cadherin基因启动子上。 三、转录复合体PAK5/LMO2/GATA1对E-cadherin基因下调的机制研究 1、用Dual-Luciferase Reporter Assay System分析GATA1是否能招募组蛋白去乙酰化酶HDACs对E-cadherin基因转录进行抑制。 2、转染不同剂量的HDAC3/4和用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理后检测GATA1和HDAC3/4对E-cadherin基因转录的影响。 3、用染色质免疫沉淀(ChIP)和ChIP-Re-IP的方法证实GATA1能直接招募HDAC3/4结合在E-cadherin基因启动子上。 4、用GST-pull down、免疫共沉淀(Co-IP)及免疫荧光(IF)结合共焦激光扫描显微镜的方法证实GATA1与HDAC3/4的相互作用。 5、用体外激酶实验探讨PAK5对LMO2和GATA1的磷酸化情况。 6、用Dual-Luciferase Reporter Assay System分析PAK5的激酶活性对E-cadherin基因转录的影响。 7、用Western Blot方法检测PAK5的激酶活性对GATA1蛋白表达及类泛素化（SUMOylation）水平的影响。 8、用免疫共沉淀(Co-IP)的方法探讨PAK5的激酶活性对GATA1类泛素化(SUMOylation)水平的影响。 9、用免疫共沉淀(Co-IP)的方法证实E3泛素连接酶PIASy存在于PAK5/LMO2/GATA1/HDAC3/4转录复合体中。 10、用免疫共沉淀（IP）的方法证实SUMO化的GATA1能招募更多的HDAC3/4，抑制E-cadherin的表达。 结果: 1、LMO2是PAK5的一个新的相互作用蛋白。 2、PAK5可在胎牛血清(FBS)的刺激下入核，并与核内转录辅因子LMO2共定位。 3、PAK5可参与LMO2/GATA1/LDB1/E47/TAL1转录复合体的形成，并可与其中的LMO2、E47、LDB1直接结合。 4、通过桥梁分子LMO2，PAK5可与转录因子GATA1间接结合，形成全新的PAK5/LMO2/GATA1转录复合体。 5、PAK5和GATA1可分别与LMO2的两个锌指结构域LIM1，LIM2结合，不竞争同一结合位点，充分体现了LMO2连接PAK5和GATA1的桥梁作用。 6、PAK5可通过与LMO2，GATA1的相互作用实现对E-cadherin表达的抑制。 7、截掉出核信号(NES)的PAK5△NES(30～83，401～411aa)突变体，绝大部分定位于细胞核中，且依然能与LMO2相互作用，抑制E-cadherin的表达。 8、转录因子GATA1的过表达可抑制E-cadherin的转录和翻译，使细胞连接松散。 9、沉默掉GATA1，E-cadherin的表达上调，细胞的迁移能力下降。 10、PAK5可增强GATA1对E-cadherin的抑制作用，从而引发EMT。 11、GATA1可结合在E-cadherin启动子的CATC(-344/-341)序列上。 12、GATA1可通过招募HDAC3/4对染色质进行修饰，从而抑制E-cadherin的表达。 13、PAK5激酶可以磷酸化GATA1，但不能磷酸化LMO2。 14、PAK5可以促进GATA1的表达，但这种促进作用与PAK5的激酶活性无关，虽然PAK5可以磷酸化GATA1。 15、PAK5对GATA1的磷酸化可促进其类泛素化(SUMOylation)水平，提高其稳定性，使其免于降解。 16、SUMO化的GATA1能招募更多的HDAC3/4，抑制E-cadherin的表达。 17、GATA1本身可以抑制E-cadherin的表达，同时PAK5又能促进GATA1的表达和提高其稳定性，使其在细胞核内富集，从而进一步抑制了E-cadherin的表达。 18、PAK5磷酸化GATA1，可促进E3泛素连接酶PIASy对GATA1的类泛素化(SUMOylation)作用，发生SUMO化的GATA1能招募更多的HDAC3/4，使E-cadherin启动子发生去乙酰化，从而达到抑制E-cadherin表达的作用。 结论: 1、PAK5可经FBS刺激入核，并与核内转录辅因子LMO2相互作用。 2、通过桥梁分子LMO2，PAK5可与转录因子GATA1形成PAK5/LMO2/GATA1转录复合体，抑制E-cadherin的表达。 3、GATA1可结合在E-cadherin启动子CATC(-344/-341)序列上，并招募HDAC3/4下调E-cadherin的表达。 4、PAK5的表达，既可促进GATA1的表达，又可SUMO化GATA1，增加其稳定性，从而进一步加强GATA1对E-cadherin的抑制作用。 5、PAK5可磷酸化GATA1，进而促进GATA1的SUMO化，SUMO化的GATA1又能招募更多的HDAC3/4，实现对E-cadherin表达的抑制。