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1实验目的全球人口疾病死亡原因排序中,以动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)为病理基础的心脑血管疾病处于第一位,对As形成机制的研究及其基础上的预防措施研究应当作为我们研究工作的重点。As只发生在具有滋养血管、滋养淋巴管所组成的滋养系统的大、中动脉而不发生在无滋养系统的小动脉,小动脉发生的是动脉纤维性硬化。迄今,As形成的医学假说主要有:血栓形成学说(1841,Rokitansky)、炎症学说(1856,Virchow)、脂质浸润学说(1863,Virchow)、单克隆学说(1973,Bendift)、损伤反应学说(1976,Ross)、氧化学说(1983,steinberg)等,但是它们都不完善,它们所整合成的As假说体系也不完善。这些学说尚不能解释As发生和发病特点中的许多现象与事实,如:①为什么冠状动脉粥样硬化只发生在淋巴滋养系统缺如的心外膜段冠状动脉,而不发生在具有淋巴滋养系统的心肌壁内的冠状动脉;②为什么移植的心脏的心肌壁内的冠状动脉容易发生As,而正常的心脏的心肌壁内冠状动脉不发生As;③为什么淋巴循环与血液循环较差的下肢As病变形成的又早又重,而淋巴循环与血液循环较好的上肢却极少发生As;④为什么As只发生在含有滋养血管和毛细淋巴管的大动脉与中动脉上,而无滋养血管和毛细淋巴管的小动脉却从不发生;⑤为什么As早期病变都是节段性分布的,而非连续性分布的。这些方面的问题大多与大动脉系统的淋巴解剖学特点密切相关。以上说明目前关于As确切发病机制的全部假说所形成的假说体系并未抓住As形成过程中的始动因素,需要进一步补充完善As形成的假说体系。大量研究显示,受损的淋巴管引流对自然的或实验性的动脉粥样硬化过程有重要影响,淋巴管阻塞可导致动脉壁发生类似动脉粥样硬化的组织学损害。在As的中医学认识方面,我们认为As的病因为由虚致痰、由痰生瘀、痰瘀化毒;基本病机为虚-痰-瘀-毒,主要病理过程为:为气虚不化,阳虚运化不振,导致膏粱湿浊积化成痰,痰盛阻络,凝结成核,络脉不通,其所养之大脉(血脉)气血壅滞,形成微痰核、癥瘕,阻于大脉,脉络不通,血运瘀阻,痰瘀缠结,聚而生毒,毒损脉络,终致疾病;病位在于大脉(血脉)。本课题旨在As形成的血管外膜滋养淋巴管微循环障碍假说沉寂十多年后,在学术界重新提出,并强调其在As形成中的重要性,建立一种基于As形成过程中解剖学和病理学原理的滋养淋巴管微循环障碍导致的As动物模型和研究平台。本研究选题具有一定的创新性、应用前景和应用价值,未来可能会创造相当的经济和社会效益。2实验方法将64只Wistar大鼠随机分为4个时间段组(3天组、7天组、14天组、28天组,每个时间段组各16只),每个时间段组又各自分为正常组和模型组(每组各8只)。模型组大鼠左侧肢体施以手术结扎其腘窝、腹股沟、腋窝三处淋巴结周围淋巴管,并切除淋巴结,建立淋巴微循环障碍模型,右侧肢体和正常组大鼠双侧肢体都不作任何处理。造模后3天、7天、14天、28天分别对模型组、正常组各8只大鼠进行麻醉、取血、灌流固定、取材。检测血常规、血生化、血液流变学等指标。取材的组织为大鼠左、右股动脉,行离体固定、包埋、切片,苏木素一伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson染色。用数码成像系统对镜下的切片进行照相,观察股动脉镜下显微结构,再用图像分析系统对照片进行分析,测量其内膜厚度、中膜厚度、中膜单位面积胶原纤维百分比、外膜单位面积小血管数目等值,并对测量结果进行统计学对比分析。3实验结果3.1血液检测结果:3天、7天、14天、28天各时间段的模型组与正常组的血常规、血生化各项指标比较,差异无显著统计学意义(P＞0.05)。血液流变学检测项目中,3天、7天、28天各时间段的模型组与正常组比较,差异无显著统计学意义(P＞0.05);14天的模型组与正常组比较,全血粘度、还原粘度、血浆粘度均显著升高,红细胞压积显著降低,差异具有显著统计学意义(P＜0.05),其他项目差异无显著统计学意义(P＞0.05)。3.2光镜下病理学改变结果3天、7天、14天、28天各时间段正常组大鼠,股动脉内膜完整平滑,内皮细胞完整,内皮细胞下层未见细胞聚集,内膜未见增厚;内弹力板致密、完整、平滑圆环状分布;中膜平滑肌层细胞核呈规则椭圆形,纵轴方向与平滑肌走行方向一致,各层弹力纤维致密规整,均呈同心圆状分布;Masson染色示,中膜中散在分布有少量浅绿色胶原纤维;外弹力板致密、完整、平滑同心圆状分布;外膜疏松结缔组织,散在分布有滋养血管、滋养淋巴管和神经纤维,管腔通畅无闭塞、无扩张迂曲现象。3天、7天、14天、28天各时间段模型组大鼠非手术侧(右侧)股动脉与正常组相比未见明显改变。3天模型组大鼠手术侧股动脉,与正常组相比,内膜轻度增厚;中膜平滑肌层胞核不再呈规则椭圆形、大且圆形细胞明显增多,纵轴方向不与平滑肌走行方向一致,Masson染色示胶原纤维面积轻微增多;外膜滋养血管开始出现管壁细胞增生现象,滋养淋巴管呈迂曲扩张状态,且外膜中的小滋养血管数目增多。7天模型组大鼠手术侧股动脉,与3天模型组比较,内膜、中膜改变相近,外膜的滋养淋巴管迂曲扩张状态及小滋养血管数目增多更显著。14天模型组大鼠手术侧股动脉,与7天模型组比较,内膜增厚更明显,中膜平滑肌层细胞可见变大变圆,排列方向稍紊乱;Masson染色示中膜中的胶原纤维含量明显增多;外弹力板疏松,欠平滑,偶见局部断裂;外膜滋养血管可见管壁增生现象,滋养淋巴管呈严重扩张迂曲状态,外膜中的小滋养血管数目明显增多成簇分布。28天模型组大鼠手术侧股动脉,与14天模型组比较,内膜增厚更加明显;中膜平滑肌层变大、变圆的细胞更多,排列更加紊乱,Masson染色示中膜的胶原纤维增多现象更明显;外弹力板更加疏松,可见断裂,外膜滋养淋巴管扩张迂曲现象更明显,小滋养管数目增多的现象更显著。3.3内膜厚度分析显示:(1)各时间段模型组手术侧与对侧及正常组对比,股动脉内膜绝对厚度均明显增加,差异具有显著统计学意义(P＜0.05);(2)3天模型组手术侧与正常组相比股动脉内膜/中膜厚度比值增加,差异具有显著统计学意义(P＜0.05),但与对侧相比股动脉内膜/中膜厚度比值差异不具有显著统计学意义(P＞0.05)。其他各时间段模型组手术侧与对侧及正常组对比,股动脉内膜/中膜厚度比值均明显增加,差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。3.4中膜单位面积胶原纤维百分比分析显示:3天模型组手术侧与对侧及正常组相比,股动脉中膜单位面积胶原纤维百分比差异不具有显著统计学意义(P＞0.05),其他三个时间段的模型组手术侧与对侧及正常组相比,股动脉中膜单位面积胶原纤维百分比均明显增加,差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。3.5外膜单位面积小滋养血管数目分析显示:四个时间段模型组手术侧与对侧及正常组相比,股动脉外膜单位面积小滋养血管数目均明显增加,差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。4实验结论4.1本实验淋巴管结扎手术操作方法不易引起慢性炎症反应,且饮食中无高糖、高脂因素的存在,不形成高血糖、高脂血症;4.2淋巴管结扎手术后14天,全血粘度、还原粘度、血浆粘度等指标均显著升高,红细胞压积降低,说明淋巴微循环障碍2周可导致大鼠血液流变学改变,但是术后28天血液流变学指标又恢复正常,可能由大鼠自身调节作用所导致;4.3淋巴管结扎手术后各时间段的模型组大鼠股动脉均发生了不同程度的病理改变,表明淋巴微循环障碍导致大鼠股动脉各层结构发生重构,外膜中淋巴管极度扩张表明了造模操作成功;4.4淋巴管结扎手术后3天、7天、14天、28天,大鼠股动脉外膜中的小滋养血管数目增多、聚集成片,可能是滋养淋巴微循环系统发生障碍后导致的滋养血管微循环系统发生的一种代偿反应。4.5淋巴管结扎手术后3天、7天、14天、28天,大鼠的股动脉内膜皆不同程度增厚,可能是淋巴循环障碍导致大鼠股动脉内膜中的代谢物质无法回流而发生了堆积;4.6淋巴管结扎手术后3天、7天、14天、28天,大鼠股动脉的中膜单位面积胶原纤维百分比增加,可以认为是一种组织物质重构,根据文献认定是一种动脉粥样硬化早期病理表现。