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低温是一种重要的非生物胁迫,对水稻等主要粮食作物的生长、产量与地理分布都会产生影响。水稻在整个生殖生长阶段都很容易受低温影响,尤其是处于小孢子早期阶段的雄配子体。东乡普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)是一个耐冷性很强的普通野生稻居群,已有的研究表明其在萌发期、幼苗期、孕穗期、开花期和灌浆期均具有很强的耐冷性。
本研究使用人工气候室以14/12℃(日/夜)低温处理幼穗发育早期的东乡野生稻,然后分别取低温对照和低温处理的东乡野生稻小孢子早期、小孢子中期两个时期共四种幼穗提取总蛋白,并通过双向凝胶电泳技术(2-DE)分离,继而通过比对图像找出低温胁迫下的差异表达蛋白。使用MALDI-TOF/TOFMS结合数据库检索鉴定这些差异蛋白,并对它们的功能进行归类,再通过半定量RT-PCR分析这些差异表达蛋白对应的mRNA在低温胁迫后的变化。此外,观察统计东乡野生稻穗发育早期受低温处理4天之后其成熟花粉育性的变化。主要研究结果如下:
1.花粉育性分析结果显示东乡野生稻在幼穗发育早期经过低温处理后成熟花粉仍能保持86～95％的可染率,比经过相同处理的栽培稻湘糯1号(XN1)表现出更强的孕穗期耐冷性。
2.2-DE及图像分析发现共有42个蛋白点在低温处理4天后发生显著变化(变化倍数大于1.5倍,p＜0.05)。表达下调的蛋白点26个,其中15个只在减数分裂和小孢子早期表达下调,7个在小孢子中期表达下调,4个在两个时期的材料中均有表达下调;表达上调的蛋白点16个,其中6个只在减数分裂和小孢子早期表达上调的有,8个在小孢子中期表达上调,2个在两个时期的材料中均有表达上调。小孢子早期和中期的幼穗在受低温处理后表达发生改变的蛋白种类存在较大差异,表明幼穗在这两个发育时期对低温应答的反应也存在差异。
3.在发现的44个差异蛋白中,挑选了丰度相对较高的26个差异表达蛋白作MALDI-TOF/TOF MS鉴定,成功鉴定出其中21个蛋白,并根据数据库中与它们功能相关的信息,将上述蛋白按照功能划分为胁迫应答与防御、细胞生长、蛋白加工降解与分子伴侣、物质代谢、光合作用、功能未知六个组,并对这些差异表达蛋白在低温胁迫应答和维持花粉育性中可能行使的功能进行分析讨论。
4.通过将我们发现的东乡野生稻的受低温处理后发生表达变化的差异蛋白,与已有的采用低温敏感栽培稻进行低温胁迫处理研究获得的差异蛋白进行比较分析,发现钙网蛋白、osmotin同源物、乙二醛变位酶Ⅰ、肌醇磷酸合酶、推测的谷胱甘肽S-转移酶以及2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase的改变模式不一致,说明这些蛋白的变化可能与东乡野生稻的耐冷性有关。
5.采用半定量RT-PCR对上述21个差异表达蛋白进行分析的结果显示:上述MALDI-TOF/TOF MS结合数据库检索鉴定的差异蛋白确实在穗中表达,但部分差异表达蛋白低温处理前后在蛋白水平与在mRNA水平的变化程度并不一致,推测这些差异蛋白可能还受到转录后水平的调控。
本研究通过蛋白质组学技术分析了东乡野生稻幼穗在低温处理前后蛋白表达的变化,发现了一些与低温应答相关蛋白,其中钙网蛋白、osmotin同源物、减数分裂丝氨酸蛋白酶以及一个锌指蛋白在低温应答中的功能以及对幼穗发育的影响,值得进一步的研究,对于探讨东乡野生稻孕穗的耐冷机制及确定新的耐冷基因具有重要的意义。