论文部分内容阅读
灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一种典型的死体营养型植物病原真菌，能引起至少235种植物的灰霉病，常给农业生产造成严重的经济损失。挖掘灰葡萄孢的致病相关基因，探究其致病的分子机制，可为制定持久控制灰霉病的策略提供理论依据和实践基础。试验室前期研究从灰葡萄孢T-DNA插入突变体库中筛选获得了一株致病力完全丧失的突变体BCt89，利用TAIL-PCR、Southern blotting、RT-PCR等技术结合生物信息学方法，明确了其突变基因为BcPDR1，该基因编码一个功能未知的假定蛋白，无同源基因和保守结构域。为进一步明确该基因的功能及其在致病过程中的作用，本研究利用基因敲除技术，获得了该基因的敲除突变体ΔBcPDR1；通过对突变体BCt89和ΔBcPDR1的表型和致病性的分析，明确了BcPDR1基因在病菌生长、发育和致病过程中的功能。通过对突变体BCt89和ΔBcPDR1的胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力、附着胞形成与穿透能力、NO产生和转运能力等分析，确定病菌BcPDR1基因缺失后丧失致病力的机制。为阐明BcPDR1基因调控病菌致病力的分子机制及其为灰霉病的防治奠定基础。1.试验构建了BcPDR1基因的同源重组载体，利用PEG介导的原生质体转化技术转化灰葡萄孢野生型菌株BC22，利用潮霉素B筛选转化子，通过PCR、Southernblotting和RT-PCR技术对转化子进行验证。确定了所获得的阳性转化子为BcPDR1基因的敲除突变体ΔBcPDR1。2.以野生型菌株BC22为对照，对突变体BCt89和ΔBcPDR1进行表型分析和致病性测定，发现突变体BCt89和ΔBcPDR1的生长速度减慢，不产生分生孢子和菌核，菌丝纤细、分隔短、颜色浅，且突变体的致病力完全丧失，确定了BcPDR1基因参与调控病菌的生长、发育和致病性。3.对突变体BCt89和ΔBcPDR1的胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力及NO产生和转运能力进行分析，发现突变体的Cx、PG和PMG的酶活性较野生型明显降低，PGTE、PMTE的酶活性及毒素活性与野生型相比没有明显差别；突变体的产酸能力较野生型明显增强；突变体的NO产生部位和转运能力与野生型有明显差别。确定了BcPDR1基因突变影响病菌胞壁降解酶活性、产酸能力及NO的产生和转运，不影响病菌的毒素活性。4.对突变体BCt89和ΔBcPDR1的附着胞形成与穿透能力进行观察，发现突变体均能穿透玻璃纸和洋葱表皮，且均能形成附着胞和侵入菌丝，但是突变体的附着胞形成和侵入菌丝的产生时间均较野生型延迟。表明BcPDR1基因对病菌附着胞的形成与穿透能力具有一定的调控作用。5.利用RT-PCR技术，检测突变体BCt89和ΔBcPDR1中致病相关基因的表达水平，发现突变体中产酶相关基因glyox1、cutA、bcpg1和bcpg2的表达水平均较野生型明显增强，god1基因的表达减弱；信号途径相关基因pka、pka2、bac、btp1、ras2的表达明显增强，edka、bcp1基因的表达减弱；产毒相关基因P450-1和bcbot1的表达明显增强；产黑色素相关基因lac1的表达明显减弱。表明BcPDR1基因缺失影响病菌致病相关基因的表达。6.对突变体BCt89和ΔBcPDR1对非生物胁迫的敏感性进行测定，发现在山梨醇、甲萘醌培养基上，突变体BCt89和ΔBcPDR1受抑制的程度显著低于野生型；在氟康唑的培养基上，突变体ΔBcPDR1受抑制的程度显著低于野生型；在NaCl、KCl、甘油、刚果红和H2O2的培养基上，突变体BCt89和ΔBcPDR1受抑制的程度与野生型相比没有明显差别。表明BcPDR1基因可能参与调控病菌的渗透胁迫反应、细胞膜的完整性及活性氧代谢过程。