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目的:器官移植作为一种有效的治疗手段,在临床上广泛应用。然而,几乎所有的移植患者都需要持续使用免疫抑制药物来防止同种异体移植排斥反应的发生。所以免疫抑制剂在器官移植中起着至关重要的作用。不过,目前常用的免疫抑制药物可能导致严重的副作用,如肾毒性、肿瘤和感染等。因此,对于长期接受免疫抑制剂治疗的临床患者来说,迫切需要开发一些具有更好的免疫抑制效果和最小副作用的新型免疫抑制分子。紫草素是一种从紫草根中提取的具有生物活性的萘醌类色素,现代药理学研究表明紫草素具有抗炎、抗癌和抗菌的作用。尤其是,紫草素被证明在动物模型中可以抑制关节炎的发展,在体外实验中还能抑制人类T淋巴细胞的活化。但目前紫草素对同种异体移植排斥反应的作用尚不明确,因此本实验通过建立小鼠皮肤移植模型,考察紫草素对同种异体排斥反应的作用,明确紫草素免疫调节的作用机制。方法:1.紫草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究研究采用小鼠皮肤移植模型,将BALB/C小鼠的皮肤移植到C57BL/6小鼠身上,造模成功后将C57BL/6小鼠随机分为四组,分别为同种异体皮肤移植组(Control)、环孢素A组(CsA)、紫草素低剂量组(Shikonin-20mg/kg)、紫草素高剂量组(Shikonin-40mg/kg),考察紫草素对移植物生存时间的影响;HE染色、免疫组化和免疫荧光分别测定移植皮片中的炎性细胞浸润及Foxp3和IDO的表达,细胞流式术检测受体小鼠外周引流淋巴结和脾脏细胞中CD4+Foxp3+Treg、效应CD8+CD44high CD62LlowT细胞、CD11c+CD80+和CD11c+CD86+成熟树突状细胞的比例,荧光定量PCR 法测定移植皮片中细胞因子 IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-6、IL-10、TGF-p1、FoxP3和IDO基因表达的水平。2.紫草素联合Anti-CD25抗体对小鼠皮肤移植排斥反应的研究研究采用小鼠皮肤移植模型,造模成功后将C57BL/6小鼠随机分为五组,分别为同种异体皮肤移植组(Control)、环孢素A组(CsA)、环孢素A联合Anti-CD25抗体组(CsA+anti-CD25)、紫草素组(Shikonin)、紫草素联合Anti-CD25抗体组(Shikonin+anti-CD25),每天给予紫草素或环孢素,在移植后第0、4和8天分别按0.2mg/只的剂量腹腔注射Anti-CD25抗体;每天观察移植皮片有无炎症、水肿、坏死、结痂及脱落等情况,并记录移植皮片的存活时间,用中位生存时间(mediansurvival time,MST)表示。3.紫草素体外实验的研究用流式细胞仪分离纯化C57BL/6小鼠的CD3+T淋巴细胞,采用CCK-8测定紫草素对T细胞的细胞毒性,流式细胞术测定CFSE标记的CD3+T淋巴细胞的增殖情况,ELISA检测培养上清液中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-17和TGF-β1的水平,Western Blotting检测mTOR信号通路的蛋白表达。分离纯化的CD4+CD25-T细胞在抗CD3e和CD28抗体(2.5μg/mL)以及rmIL-2(10ng/mL)共刺激后,分别给予TGF-β1(5ng/mL)和不同浓度的紫草素(0.25μM或0.5μM),四天后采用流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg的比例。分离纯化C57BL/6小鼠骨髓中的树突状细胞,在rmGM-CSF(20ng/mL)和rmIL-4(1Ong/mL)的共刺激下,分别给予环孢素(0.1μM)和不同浓度的紫草素(0.25μM或0.5μM),两天后收集细胞采用Western Blotting检测其中IDO的蛋白表达。结果:1.紫草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究紫草素低剂量(20mg/kg)和高剂量(40mg/kg)组均能显著延长同种异体皮肤移植的存活时间,MST分别是16.00±1.37和22.00±2.98天(P<0.05或P<0.01),甚至紫草素高剂量的治疗效果接近于CsA(MST为26.00±1.49天)(PP>0.05);紫草素低剂量和高剂量治疗后小鼠移植皮片中CD3+T细胞浸润明显减少(P<0.05或P<0.01),同时可上调移植皮片中Foxp3和DC来源的IDO的表达(P<0.01)。在受体小鼠次级淋巴器官中,紫草素低剂量和高剂量组均能显著增加引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例(P<0.05或P<0.01),同时可显著降低脾脏和淋巴结细胞中CD11c+CD86+成熟树突状细胞和CD8+CD44highCD62Llow效应T细胞的比例(P<0.05 或P<0.01)。在移植皮片中,紫草素低剂量和高剂量组均能显著降低促炎因子TNF-α和IL-17的mRNA表达(P<0.05或P<0.01),以及显著升高FoxP3和IDO mRNA的表达水平(P<0.05或P<0.01),紫草素高剂量还能抑制IFN-γ和IL-6的mRNA表达(P<0.05 或P<0.01),同时上调 IL-10和 TGF-β1 mRNA 的表达(P<0.05)。2.紫草素联合Anti-CD25抗体对小鼠皮肤移植排斥反应的研究实验结果表明,Shikonin+anti-CD25 组的 MST 是 16.00±0.75 天,与 Shikonin 单独给药组(MST=25.00±2.83天)相比,明显减少了小鼠的存活时间(P<0.05);而CsA+anti-CD25组与CsA单独给药组相比没有显著差异(P>0.05)。3.紫草素体外实验的研究不同浓度的紫草素(0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 μM)给药24h、48h和96h后,紫草素的给药浓度至1.OμM时,对T细胞并没有细胞毒性作用。在T细胞增殖实验中,紫草素(0.25μM)组和紫草素(0.5μM)组均能显著抑制T细胞的增殖(P<0.01),尤其是高剂量组的抑制效果与CsA组接近(P>0.05);此外,紫草素(0.25μM)组和紫草素(0.5μM)组均能显著降低细胞上清液中IFN-γ的水平(P<0.01),仅紫草素(0.5μM)组可下调IL-17的浓度(P<0.05),同时还能上调了抑制型细胞因子IL-10和TGF-β1在细胞上清液中的水平(P<0.05或P<0.01);而CsA可以提高细胞上清液中TGF-β1的浓度(P<0.01)但对IL-10无影响(P>0.05);在体外分离纯化的CD4+CD25-T细胞中,紫草素(0.25μM)组和紫草素(0.5μM)组均能显著提高CD4+Foxp3+Treg 的比例(P<0.05 或P<0.01)。对于T细胞上mTOR信号通路,紫草素(0.25μM)组和紫草素(0.5μM)组均能显著抑制P-p70S6K和P-mTOR的活化(P<0.01),而作为阳性对照雷帕霉素在很大程度上阻断了 P-p70S6K和P-mTOR的激活(P<0.01)。在体外诱导的髓源性树突状细胞中,紫草素(0.25μM)组和紫草素(0.5μM)组均能在体外增强树突状细胞IDO的蛋白表达(P<0.05或P<0.01),而环孢素却没有显著差异(P>0.05)。结论:我们实验结果揭示了紫草素在诱导Tregs/IDO和抑制同种异体移植排斥反应中的新作用,表明紫草素可显著延长同种异体皮肤移植小鼠的存活时间,其可能的作用机制是诱导CD4+Foxp3+Treg的分化,促进DC来源IDO的表达以及抑制了 mTOR信号通路的激活。因此,紫草素作为一种天然产物,在未来可能作为一种潜在的免疫抑制药物用于临床器官移植手术。