玉米大斑病菌StMAT2基因在两性菌株有性生殖中的作用

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玉米大斑病是近年来玉米生产上的主要病害,其病原为大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica(tuttrell)Leonard et Suggs.),属异宗配合真菌,病菌存在A交配型、a交配型、Aa两性交配型以及中性菌株,其中,A交配型菌株含有MAT1基因,编码α1转录因子,a交配型菌株具有编码高迁移率蛋白(high mobilitygroup,HMG)家族的MAT2基因。前期研究发现,玉米大斑病菌有性生殖过程中两性菌株Aa的育性与杂交时对应菌株的交配型组成相关,两性菌株与A交配型菌株或与a交配型菌株杂交均可育,能产生成熟的子囊壳和子囊孢子,但其自交时败育,只能产生子囊壳不能产生子囊孢子,推测MAT基因在有性生殖产生子囊壳的过程中发挥着重要作用。本文在前期研究基础上,通过酵母自激活试验明确了玉米大斑病菌StMA T2基因具有转录激活活性和转录因子的特有结构,通过原生质体转化的方法创制了该基因的缺失突变体,经对突变体的有性生殖能力和相关基因表达分析,初步明确了StMAT2基因在病菌两性交配型菌株有性生殖中的作用,主要结果如下:  1.通过有性态诱导发现,野生型菌株01-23与A交配型菌株和a交配型菌株杂交均能产生子囊壳、子囊和子囊孢子;经PCR鉴定和Southern blot分析表明,在菌株01-23中存在StMAT1和StMAT2两个交配型基因,说明菌株01-23为Aa两性交配型菌株;  2.采用qRT-PCR的方法分析两性菌株Aa自交及其与A交配型或a交配型菌株杂交时交配型基因的表达规律,结果表明,有性态诱导0d、15d、30 d和60 d时StMAT1和StMAT2基因均有表达,随着诱导时间的延长,StMAT2基因在不同诱导组合中的表达量都呈显著增高的趋势,说明StMAT2在玉米大斑病菌有性生殖过程中起着重要作用;  3.生物信息学分析表明,StMAT1和StMA T2均为转录调控因子,通过构建StMAT2诱饵表达载体,对其自激活活性进行了检测,结果表明,StMAT2基因编码产物具有较高的转录激活活性,证明StMAT2为转录调控因子;  4.构建了StMAT2基因敲除载体,通过原生质体转化的方法获得了3株StMAT2基因缺失转化子,利用PCR、qRT-PCR和Southern blot的方法确定了3株转化子均为StMAT2基因缺失突变体;对StMAT2基因敲除突变体的表型进行分析发现,与野生型相比△StMAT2生长7d时其菌落颜色较野生型菌株浅,菌丝形态无明显变化,突变体在PDA和LCA培养基上生长到30 d时均不能产生分生孢子,说明StMAT2基因缺失影响了玉米大斑病菌分生孢子产生能力;  5.通过生物信息学预测获得了8个StMAT2可能调控的有性生殖相关基因,并对其蛋白进行了Blast比对,最终确定StMAT2可能调控的有性生殖相关基因所属蛋白类群涉及调控分生孢子生长发育、新陈代谢、DNA结合、信号转导及其育性等方面;利用qRT-PCR技术分析了StMAT2调控的靶基因在有性态诱导过程中的表达规律,结果表明,两性菌株Aa与A交配型或a交配型菌株杂交时,StMAT2调控的靶基因的表达量随诱导时间的延长逐渐增加;  6.比较分析了△StMA T2突变体和野生型菌株不同诱导时期StMAT2可能调控的8个靶基因的表达量及其变化规律,结果表明,与同一时期野生型菌株相比,两性菌株自交或与A交配型菌株杂交时,突变体中除96271和157792表达量升高,其它6个基因的表达量均低于野生型;两性菌株与a交配型菌株杂交时,突变体△StMAT2中8个靶基因的表达量均低于野生型菌株。
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