论文部分内容阅读
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种猪的急性、高度接触性肠道传染病。自1978年报道以来在欧洲以及亚洲许多国家相继爆发,给养猪业带来巨大损失,因此对于PED的诊断以及疫苗的研究就显得尤为重要。PEDV纤突糖蛋白(S)是位于病毒粒子表面的结构蛋白,它既含有介导病毒侵入宿主细胞的受体结合域,又拥有介导机体产生病毒中和抗体的抗原表位,具有良好的免疫原性。利用生物学软件对PEDV S基因进行了抗原位点分析,在不破坏线性抗原位点的前提下将S基因进行分割获得S基因的片段命名为S1。本试验在高效表达PEDV S1蛋白后,利用噬菌体展示技术筛选并鉴定了能与PEDV S1蛋白相互作用的多肽分子,为进行PED的快速诊断以及开发有效的新型疫苗奠定了基础。本试验成功构建了编码PEDV S1蛋白的pET30a-S1原核重组表达质粒,并在E.Coli Rosetta中进行原核表达。将制备并纯化的重组蛋白进行复性和活性检测,结果表明这种融合蛋白具有一定的生物学活性。以重组蛋白为免疫原免疫新西兰白兔制备了多克隆抗体。免疫荧光实验以及病毒抑制实验证明此多克隆抗体具有良好的生物学活性。利用噬菌体随机十二肽库,以PEDV S1重组蛋白为靶分子,对其进行了四轮生物淘选。对第四轮洗脱物随机淘选出的10个噬菌体单克隆的核苷酸序列进行测定,并进行多肽序列的推导,结果表明,经过对靶分子的四轮筛选后,最终筛选出三个具有高度同源性的多肽,序列分别是MPAVMSSAQVPR,NLSNRLNLSPGI,YVIHQPYAMALR。ELISA方法对合成多肽的检测结果表明这三条多肽均能与重组的PEDV S1蛋白结合。病毒体外抑制实验表明所筛选出来的其中两条多肽M和N具有良好的生物活性。体内实验通过免疫昆明鼠检测了多肽的抗病毒活性,结果表明多肽M、N在小鼠体内起到了一定的中和病毒的作用。本实验为建立新的PED诊断方法以及新型多肽疫苗的开发提供了一定的理论基础和实验依据。