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研究目的：
肺癌在人类为常见多发病，5年生存率仅为5％～10％，被确诊时80％以上已属于中晚期，目前无有效治疗药物，MAGE-12在一定类型的肺癌中有较高表达，表达率为22％～34％，MAGE-12与MAGE-2和MAGE-3有高度同源性，且在肺癌中表达率分别为30％、46％，MAGE-3的黑色素瘤肽疫苗已进入临床I期试验。如能预测并鉴定出MAGE-12的表位，则有望找到高效特异性治疗肺癌的肽疫苗，即在肺癌免疫治疗中，除了MAGE-3外，MAGE-12成为抗原疫苗的可能性，因此预测并鉴定MAGE-12的表位具有重要意义。MAGE-12的免疫原性是治疗肿瘤的基础，本课题在前期研究的基础上检测MAGE-12在11种人肿瘤细胞株中mRNA水平和蛋白水平的表达，预测和鉴定肿瘤抗原MAGE-12的新B细胞表位，并观察人参总皂苷对MAGE-12<,82-93>的B细胞表位抗体的增效作用。同时，对肿瘤抗原MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位进行预测，经计算机分子模拟，建立候选表位HLA-A2-肽复合物分子模型，以发现候选表位与HLA-A2分子结合情况，为实验验证肿瘤抗原MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位提供依据，为多表位联合使用打下基础，特别是为中药提取物联合应用提供实验依据。
研究方法：
本研究以MAGE-12为例，采用RT-PCR和免疫组化技术，检测了MAGE-12在11种细胞株中MAGE-12 mRNA水平和蛋白水平的表达。采用Garnier-Robson和Chou-Fasman方案预测肿瘤抗原MAGE-12的α-螺旋二级结构，用Kyte-Doolittle亲水性方案预测肿瘤抗原MAGE-12的新B细胞表位。在预测的B细胞表位基础上，采用4分枝MAP(多重抗原肽)结构设计合成抗原肽，免疫C-57BL/6小鼠，产生多克隆抗体，应用ELISA实验证明多克隆抗体为抗原肽的特异性抗体，用已知的MAGE-12表达阳性的LB373-MEI细胞和已知MAGE-12表达阴性的293细胞(人胚肾正常细胞)作免疫组化染色，证明产生的抗体为人的MAGE-12的特异性抗体，以上两结果证明所预测的表位为MAGE-12的新B细胞表位。本研究采用ELISA法，进行了小鼠抗体滴度的动态测定，证明人参总皂苷对MAGE-12<,82-93>的B细胞表位有免疫促进作用，能够提高抗体效价。本研究采用超基序方法、量化基序方法、多项式法与延展基序方案相结合对肿瘤抗原MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位进行预测，同时，经计算机分子模拟，建立了候选表位HLA-A2-肽复合物分子模型，以发现候选表位与HLA-A2分子结合情况，同时计算候选表位的P2和P9残基间的距离，P1氨基酸残基侧链的指向，P2氨基酸残基的定位，P9氨基酸残基侧链的指向。
研究结果：
在11例细胞株中，6例表达MAGE-12 mRNA，分别为黑色素瘤细胞系LB373-MEL(阳性对照)、人肺鳞癌(命名L78)细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人肺腺癌(命名PG)细胞株、肝癌细胞株HepG2、卵巢癌细胞株SKOV3。在11例细胞株中，3例表达MAGE-12蛋白，分别为黑色素瘤细胞系LB373-MEL(阳性对照)、人肺鳞癌(命名L78)细胞株、人肺腺癌A549细胞株。既MAGE-12在5种人肺癌细胞株中，3种mRNA水平的表达，分别为人肺鳞癌细胞株(命名L78)、人肺腺癌细胞株A549、人肺腺癌细胞株(命名PG)；2种蛋白水平表达，分别为人肺鳞癌细胞株(命名L78)、人肺腺癌细胞株A549。2种蛋白水平表达的细胞株及1种已知阳性表达MAGE-12的LB373-MEL细胞系，做免疫组化染色呈阳性反应，细胞可见棕黄色反应颗粒。而用已知MAGE-12表达阴性的293细胞(人胚肾正常细胞)作免疫组化染色，293细胞呈阴性反应，细胞无棕黄色反应颗粒。
我们采用Garnier-Robson和Chou-Fasman方案预测肿瘤抗原MAGE-12的α-螺旋二级结构，有10个α-螺旋中心分别在1-6、14-29、32-39、53-55、105-137、153-170、216-229、245-251、284-291、305-314。用Kyte-Doolittle亲水性方案预测肿瘤抗原MAGE-12的新B细胞表位，为LEQRSQHCKPEE(3-14)。在预测的新B细胞表位基础上，采用4分枝MAP结构设计合成抗原肽，免疫C-57BL/6小鼠，产生多克隆抗体，抗体滴度达1:256。应用ELISA实验证明多克隆抗体为抗原肽的特异性抗体，用已知MAGE-12表达阳性的LB373-MEL细胞和已知的IvlAGE-12表达阴性的293细胞(人胚肾正常细胞)作免疫组化染色，LB373-MEL细胞呈阳性反应，细胞可见棕黄色反应颗粒；而293细胞呈阴性反应，细胞未见棕黄色反应颗粒。此结果证明产生的抗体为人的MAGE-12的特异性抗体，以上两结果证明所预测的表位为MAGE-12的新B细胞表位，为MAGE-12<,3-14>(LEQRSQHCKPEE)。
本研究采用酶联免疫试验间接法，进行了小鼠抗体滴度的动态测定，MAP(多重抗原肽)组、人参总皂苷组最大稀释度分别为1:64，1:256，这证明产生的抗体为MAGE-12<,82-93>的特异性抗体。人参总皂苷组抗体效价明显高于MAP组，此研究结果说明人参总皂苷对B细胞表位有免疫促进作用，能够提高抗体效价，为人参总皂苷作为肽疫苗粘膜佐剂的应用提供实验依据。
本研究采用超基序方法、量化基序方法、多项式方法与延展基序方法相结合对肿瘤抗原MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位进行预测，4个候选表位为①ALSRKMAEL(108-116)(-21.17)②KMAELVHFL(112-120)(-21.89)③YILVTCLGL(176-184)(-22.10)④GLLGDNQIV(188-196)(-19.81)，MAGE-12的KMAELVHFL(112-120)与MAGE-2的表位KMVELVHFL(112-120)相类似。同时，经计算机分子模拟，建立了候选表位HLA-A2-肽复合物分子模型，发现 4 个候选表位均能与HLA-A2分子结合，其中2个候选表位②KMAELVHFL(112-120)(-21.89)④GLLGDNQIV(188-196)(-19.81)的P2、P9两个氨基酸残基间的距离均在15-19A之间，氢键数在8-9之间，Pl氨基酸残基侧链指向溶液，P2氨基酸残基定位于HLA-A2分子肽结合槽的B口袋附近，P9氨基酸残基侧链指向HLA-A2分子肽结合槽的F口袋，完全符合HLA-A2限制性CTL表位的要求。
研究结论：
1.在11种细胞株中(分别为黑色素瘤细胞系LB373-MEL(阳性对照)、人胚肾细胞株293(阴性对照)、人肺鳞癌(命名L78)细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人肺腺癌(命名PG)细胞株、人肺腺癌细胞株SPCAl、人小细胞肺癌NCI-H446、肝癌细胞株HepG2、卵巢癌细胞株SKOV3、0C3、OVCAR3)，6种表达MAGE-12 mRNA(分别为黑色素瘤细胞系LB373-MEL(阳性对照)、人肺鳞癌(命名L78)细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人肺腺癌(命名PG)细胞株、肝癌细胞株HepG2、卵巢癌细胞株SKOV3。)，3种表达MAGE-12蛋白(分别为黑色素瘤细胞系LB373-MEL(阳性对照)、人肺鳞癌(命名L78)细胞株、人肺腺癌A549细胞株)。既MAGE-12在5种人肺癌细胞株中，3种mRNA水平的表达，分别为人肺鳞癌细胞株(命名L78)、人肺腺癌细胞株A549、人肺腺癌细胞株(命名PG)；2种蛋白水平表达，分别为人肺鳞癌细胞株(命名L78)、人肺腺癌细胞株A549。以上研究结果和前期工作(初步观察到MAGE-12的mRNA水平和蛋白水平在部分肺鳞癌和部分肺腺癌组织中表达，表达率在22％～34％。)表明MAGE-12在一定类型的肺癌中有较高比例表达，可望成为肺癌免疫治疗的靶基因。
2.用Kyte-Doolittle亲水方案预测肿瘤抗原MAGE-12新B细胞表位，为MAGE-12<,3-14>(LEQRSQHCKPEE)。
3.预测的B细胞表位MAGE-12<,3-14>(LEQRSQHCKPEE)鉴定为人MAGE-12的新B细胞表位。
4.人参总皂苷对MAGE-12<,82-93>的B细胞表位抗体有免疫促进作用，能够提高抗体效价。
5.4个预测表位为①ALSRKMAEL(108-116)②KMAELVHFL(112-120)③YILVTCLGL(176-184)④GLLGDNQIV(188-196)，并通过计算机分子模拟得2个抗原表位为②。KMAELVHFL(112-120)④ GLLGDNQIV(188-196)，完全符合HLA-A2限制性CTL表位的要求。