论文部分内容阅读
尽管肾脏疾病的根底疾病不同：肾小球肾炎、糖尿病肾病、高血压肾病、药物性肾病等，但一旦肾脏损伤达到一定程度，肾脏疾病的进程多是进行性的，不可逆的，独立于原发损害。肾间质的纤维化(renal interslitial fibrosis，RIF)、管周毛细血管网的丢失，进而肾小管的萎缩、肾小球的硬化是终末期肾病(end-stagerenal disease，ESRD)的共同途径。以往针对肾间质纤维化的研究，多集中于肾小管上皮细胞、间质细胞活化、粘附因子的表达、炎症细胞的浸润。近年来肾脏微血管内皮细胞的损伤和修复，微血管病变和肾间质慢性缺氧及纤维化的关系已经得到国内外学者的共识。肾间质微血管主要指源于出球小动脉并分布于肾小管周围的毛细血管，即肾小管周围毛细血管(Peritubular capillary，PTC)，肾小管周围毛细血管在维持肾小管正常的结构和功能起关键作用。近年来的研究提出，在多种肾病中，无论病因如何，均存在肾间质微血管病变，PTC分布紊乱减少，而且PTC减少程度与肾间质纤维化呈正相关。因此如何解决PTC丢失，保护肾脏微血管内皮细胞是治疗肾间质纤维化的重要环节。
肌成纤维细胞的超微结构介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间，比普通的成纤维细胞具有更强的增殖和分泌胶原的能力，是促成肾脏及其它器官纤维化的重要因素，而且其在纤维化部位持续存在。近来发现在心肌纤维化和肺纤维化过程中，内皮细胞可以向肌成纤维细胞转分化(endothelial-myofibroblast transition，EndoMT)发挥了重要作用。在慢性肾脏病进展过程中是否存在内皮细胞向肌成纤维细胞的转化，从而加重肾间质纤维化的发生发展，这是向肾脏工作者提出的新的研究方向。
Netrin-1是Serafini1994年发现的一种主要的神经轴突导向因子，它是层粘连蛋白样分子，具有明确的主要组织区域，属于层粘连相关家族中的轴突导向分子。在神经系统中其经典的作用是通过与其受体DCC和UNC5H结合引导神经轴突的生长与诱导生长锥的的迁移。近来有学者发现，由于神经和血管分支走向的高度相似性，引导神经定向生长的轴突导向因netrin-1也能诱导血管的新生。体内、体外的研究表明netrin-1是内皮细胞的促有丝分裂原，能够促进内皮细胞迁移和增殖，发挥诱导血管新生的作用，netrin-1是白细胞吸引的潜在抑制剂，能够抑制粘膜缺氧导致的炎症反应。为应用netrin-1保护血管内皮细胞，修复PTC，改善肾间质纤维化，延缓肾脏病进展提供契机。
5/6肾切除的典型病理改变为肾小球硬化、肾间质纤维化，表现与人类肾脏纤维化相一致的病理过程。是研究慢性肾脏病、肾纤维化的理想动物模型。
本实验从以下三个方面进行了研究：①netrin-1在正常大鼠肾脏的表达定位、在5/6肾切除中大鼠肾组织中的变化及其与管周毛细血管网之间的关系；②肾脏血管内皮细胞是否可以向肌成纤维细胞转分化；③netrin-1对5/6肾切除大鼠肾脏的保护作用及可能机制。
材料与方法：
第一部分：雄性SD大鼠48只，随机分为2组：①模型组(n=24只)大鼠行10％水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg)后，俯卧位固定于手术台上，从距左脊肋骨1.5厘米处斜向外方切口，暴露左肾，分离肾周围脂肪囊后，弧行切除肾上下极各1/3，用明胶海绵压迫止血1分钟，复位肾脏，缝合。1周后切除整个右肾，2次共切除5/6肾脏；于造模后第4、8、12周分别处死大鼠8只。②假手术对照组(n=24只)仅以水合氯醛腹腔注射麻醉后暴露并剥离肾包膜，不做肾切除。于造模后第4、8、12周分别处死大鼠8只。大鼠在处死前留24小时尿蛋白定量，处死时留取血及肾组织标本。血标本作血尿素氮、血清肌酐检测；尿标本行24小时尿蛋白定量；肾组织石蜡切片常规HE和Masson染色观察肾脏组织病理改变，电镜观察肾小管周围血管内皮细胞的超微结构变化。应用免疫组织化学技术观察各组、各时间点大鼠肾组织netrin-1、PTC密度、HIF-1α表达情况；Western blot技术检测netrin-1、HIF-1α蛋白的表达。
第二部分：16只雄性SD大鼠只随机分为2组：①手术组(n=8只)大鼠行10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg)后，俯卧位固定于手术台上，从距左脊肋骨1.5厘米处斜向外方切口，暴露左肾，分离肾周围脂肪囊后，弧行切除肾上下极各1/3，用明胶海绵压迫止血1分钟，复位肾脏，缝合。1周后切除整个右肾，2次切除5/6肾脏。②假手术对照组(n=8只)仅以水合氯醛注射麻醉后暴露并剥离肾包膜，不做肾切除。于造模后第12周处死大鼠，留取肾组织石蜡切片常规HE和Masson染色观察肾脏组织病理改变；肾组织冰冻切片行CD31、α-SMA间接免疫荧光双染色后应用共聚焦显微镜观察肾脏血管内皮细胞转分化的情况。
第三部分：32只雄性SD大鼠，随机分为3组：①治疗组12只，大鼠行10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg)后，俯卧位固定于手术台上，从距左脊肋骨1.5厘米处斜向外方切口，暴露左肾，分离肾周围脂肪囊后，弧行切除肾上下极各1/3，用明胶海绵压迫止血1分钟，复位肾脏，缝合。1周后切除整个右肾，共切除5/6肾脏；于第2次手术同时肾静脉注射裸质粒pCMV-NETRIN-1-IRES2-EGFP(100μg，0.2ml)，按文献方法注射前左肾动、静脉同时钳夹，在2秒钟内注射完毕，术后第12周外死大鼠。②模型组12只，大鼠行10%水合氯醛麻醉(3ml/kg)后，俯卧位固定于手术台上，从距左脊肋骨1.5厘米处斜向外方切口，暴露左肾，分离肾周围脂肪囊后，弧行切除肾上下极，用明胶海绵压迫止血1分钟，复位肾脏，缝合。1周后切除整个右肾，2次切除5/6肾脏；行第2次手术同时于左肾静脉注入质粒IRES2-EGFP(100μg，0.2ml)，方法同上。③假手术对照组12只，仅以水合氯醛注射麻醉后暴露并剥离肾包膜，不做肾切除，行第2次手术同时于左肾动脉注入等量的生盐水(0.2 ml)。治疗组及模型组于质粒转染后1、4、8、12周各处死1只大鼠，于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。术后第12周处死大鼠，大鼠在处死前留尿测24小时尿蛋白定量，处死时留取血行肾功检查。肾标本做HE和Masson染色观察netrin-1治疗后肾脏组织形态学变化情况。肾组织冰冻切片行CD31、α-SMA间接免疫荧光双染色后应用共聚焦显微镜观察肾脏血管内皮细胞转分化的情况。采用免疫组化方法检测治疗前后管周毛细血管密度的改变；PT-PCR方法检测治疗前后netrin-1、MCP-1、HIF-1α的mRNA表达变化；Western blot技术检测治疗前后netrin-1、MCP-1、HIF-1α的蛋白表达变化。数据处理：采用SPSS12.0统计软件分析处理，计量数据X±s，组间差异采用单因素方差分析，P<0.05为有显著性差异。
结果
第一部分：①一般状态观察：假手术组表现机警，反应快，皮毛致密、整齐而有光泽，生长、进食及活动情况均无明显异常。模型组从术后4周起出现明显营养不良，精神萎靡、活动迟缓，食欲不振、皮毛蓬松、枯槁无光泽，体重增长缓慢，第11周时足部出现不同程度水肿，各组大鼠体质量随时间的延长而增加。各组组内4、8、12周相比，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与假手术大鼠体重相比，第8、12周模型组体重明显减少(P<0.05)。②生化指标检查结果：模型组第4周开始，BUN和Scr开始升高，与假手术相比有显著差异(P<0.01)，第8周和12周呈逐渐升高趋势，与对照组相比均有显著性差异(P<0.01)，模型组第4、8、12周，尿蛋白逐渐升高，与假手术相比，均有显著性差异(P<0.01)。③大鼠肾脏的病理变化：假手术组4、8、12周肾小球肾小管基本正常，肾间质相对面积分别为0.022±0.004，0.025±0.003，0.028±0.012；模型组第4周出现系膜增生，间质内见单核细胞、淋巴细胞浸润，肾间质相对面积0.123±0.042；模型组第8周肾小球系膜系膜重度增生，细胞增多，肾小球囊壁增厚、间质增宽，纤维组织增多，轻度纤维化，肾间质相对面积为0.265±0.065；模型组第12周肾小球球囊粘连，出现局灶性节段灶硬化的肾小球硬化，肾小管灶状萎缩和代偿性肾间质纤维化，肾间质相对面积为0.472±0.093。电镜检查假手术组内皮细胞结构正常，模型组逐渐出现线粒体空泡样变性，基底膜厚薄不均，模糊，局部出现断裂。④肾脏管周毛细血管密度的改变：应用免疫组织化学染包CD34蛋白阳性表达为棕黄色，位于管周毛细血管网内皮细胞及肾小球毛细血管网，通过CD34计算出PTC密度。假手术组4、8、12周PTC分别为41.96±5.08/0.13mm2、42.65±6.32/0.13 mm2、43.61±6.94/0.13mm2，模型组分别30.25±5.62/0.13mm2、17.28±3.61/0.13mm2、5.06±1.37/0.13 mm2。⑤大鼠肾脏组织Netrin-1，HIF-1α蛋白表达定位及蛋白表达的改变：免疫组织化学结果显示netrin-1蛋白阳性表达为棕黄色，位于肾小管细胞的胞浆中。假手术组肾小管胞浆大量表达netrin-1，IOD分别为(48.36±12.54)×103、(45.69±10.25)×103、(43.94±11.82)×103。在以后的时间点模型组第4周可见netrin-1表达减少，IOD值为(31.62±6.51)×103，第8周(18.67±4.02)×103、12周表达进一步减少，IOD值为(6.31±2.01)×103，与假手术组相比，P值均<0.01。HIF-1α表达于细胞核，在假手术组各时间点，几乎无表达。模型组于第8周开始表达增强，于假手术相比P值均<0.01。应用Western blotting方法表明netrin-1在假手术组中均为高表达，而在模型组表达逐渐下降。HIF-1α蛋白在假手术组及模型组第4周几乎无表达，在模型组第8、12周表达明显增加。
第二部分：内皮细胞向成纤维细胞转分化的鉴定①假手术对照组中CD31于肾小球及肾间质毛细血管内广泛表达。α-SMA主要在小动脉壁表达，肾小球和肾小管间质偶见阳性表达。②手术组CD31于肾小球和肾间质毛细血管中仍表达，因肾小球硬化及肾间质血管减少而表达减少。α-SMA在手术组肾小球内可见阳性表达，尤其以肾小球血管极多见，肾小管和间质均可以见到大量表达。⑧CD31和α-SMA共表达为黄色荧光信号。假手术组未见。而模型组见部分α-SMA阳性的间质细胞同时表达CD31，二者共定位的部位呈黄色颗粒。
第三部分：①肾功能测定结果：模型组BUN、Scr逐渐升高，第12周分别为31.26±7.83 mmol/L、141.8±27.6μmol/L，与假手术对照组比较有统计学意义P<0.01；治疗组BUN、Scr明显降低为18.14±4.59 mmol/L、114.7±37.2μmol/L，与模型组比较有统计学意义，P<0.01，但仍高于假手术对照组，差异有统计学意义P<0.01。②24小时尿蛋白结果：模型组第12周尿蛋白升高，与假手术对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；治疗组24小时尿蛋白升高，与假手术对照组比较差(P<0.01)；模型组与治疗组相比无显著性差异(P>0.05)。③肾脏病理学检查发现模型组损伤严重，肾间质纤维化明显，肾间质纤维化面积为0.487±0.140，治疗组肾脏损伤减轻，纤维化程度降低，纤维化面积为0.272±0.009，与假手术对照组和治疗组相比，模型组大鼠肾间质纤维化面积明显增加P<0.01。④内皮细胞转分化的鉴定：间接免疫荧光染色共聚焦显微镜观察可见治疗组CD31和α-SMA共表达明显少于模型组。⑤肾脏管周毛细血管网的改变：免疫组化染色显示CD34蛋白阳性表达为棕黄色，位于管周毛细血管网内皮细胞及肾小球毛细血管网，通过CD34计算出PTC密度。假手术组、模型组、治疗组的PTC分别为42.39±4.76/0.13 mm2、4.98±2.01/0.13 mm2、18.31±3.72/0.13 mm2。治疗组的PTC明显高于模型组，但仍低于假手术组，P均<0.01。⑥肾脏组织Netrin-1、MCP-1、HIF-1α蛋白表达的改变：治疗组Netrin-1阳性表达较模型组明显增多，模型组表达减少，甚至完全缺乏，P<0.01；治疗组肾脏MCP-1少量表达，模型组肾小管肾小球及间质MCP-1表达明显增强，表达量高于治疗组和假手术对照组P<0.05。治疗组肾脏HIF-1α阳性表达比模型组明显减弱，但仍明显高于正常组P均<0.01。以上指标肾脏免疫印迹分析显示了同样的变化趋势。⑦肾脏组织Netrin-1、MCP-1、HIF-1α基因表达的改变：治疗组肾脏Netrin-1的mRNA表达水平较模型组增加，与模型组相比P<0.01；治疗组肾脏MCP-1的mRNA表达水平较模型组下降，P<0.01；治疗组肾脏MCP-1的mRNA表达水平较模型组下降，P<0.01。
结论
本研究结果表明：
(1)Netrin-1在大鼠的肾小管上皮细胞胞浆内表达，在5/6肾切除的肾组织中netrin-1随着肾脏纤维化的进展逐渐减少。
(2)5/6肾切除大鼠的残肾组织中PTC密度随疾病进展逐渐减少，在残肾组织netrin-1表达下降和PTC的减少成正相关。netrin-1在残肾组织中表达下降，可能是管周毛细血管网减少的原因之一。
(3)Netrin-1基因转染后上调表达netrin-1能明显减轻5/6肾切除大鼠残肾组织的病理损害，减轻肾间质纤维化面积，增加PTC密度、降低HIF-1α表达，改善肾间质小管缺氧状态。
(4)Netrin-1可能通过促进内皮细胞增殖和抑止炎症反应而减少内皮细胞转分化，从而增加PTC密度而起到肾脏保护作用。