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目的:比较白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)联合肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)与HGF单独体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为肝细胞的能力,寻找适宜的BMSCs诱导分化为肝细胞的方法。方法:1.骨髓间充质干细胞的分离:选4周龄健康的SD雄性大鼠,脱颈处死,无菌条件下获得股骨及胫骨,去除骨骺端,冲洗骨髓腔直至变白,收集细胞悬液。2.骨髓间充质干细胞纯化及传代:将细胞悬液离心后重悬细胞,然后接种于培养瓶后置于培养箱中培养,倒置相差显微镜下观察细胞贴壁情况及形态。待细胞长满瓶底约90%时,进行传代。3.骨髓间充质干细胞的鉴定:将传至第三代生长良好且活性度高的细胞用CD45、CD90、CD29抗体进行流式细胞检测。骨髓间充质干细胞CD90、CD29表达阳性,CD45表达阴性。4.骨髓间充质干细胞的诱导分化:将符合要求的骨髓间充质干细胞以浓度为1x10~6/ml接种于置入细胞爬片的六孔板中。待细胞贴壁后,24小时后根据分组在基础培养基中加入不同的细胞因子进行持续诱导分化。分组如下:A组(空白对照组):基础培养基;B组(肝细胞生长因子组):HGF20ng/mL+基础培养基;C组(HGF+低浓度IL-1β组):HGF 20ng/mL+IL-1β5ng/mL+基础培养基;D组(HGF+中浓度IL-1β组):HGF 20ng/mL+IL-1β10ng/mL+基础培养基;E组(HGF+高浓度IL-1β组):HGF 20ng/mL+IL-1β20ng/mL+基础培养基。分别于加入细胞因子的第7天、第14天、第21天取出细胞爬片在倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化。采用免疫细胞化学方法检测诱导分化的细胞白蛋白(Albumin,ALB)、甲胎蛋白(Alph Fetal Protein,AFP)和细胞角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)表达情况。其中检测细胞表达白蛋白可表明生成的细胞为肝细胞。每组取6张细胞爬片,每张爬片随机选5个非重复高倍镜视野(x200),计数100个细胞,计数阳性染色细胞所占百分比,取其平均值。胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞。使用SPSS20.0用于统计描述与分析,计量资料采用均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用最小差异显著法,当P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果:1.骨髓间充质干细胞的鉴定:流式细胞技术检测细胞CD29、CD90高表达,CD45低表达,符合骨髓间充质干细胞表型。2.诱导生成细胞形态:光镜下观察诱导后A组无形态学改变。B组到E组细胞形态发生明显的变化,细胞由梭形、棱形逐渐向多角形、类圆形发展,7天后出现卵圆形改变,与肝细胞相似,并且各组诱导生成的细胞形态大致相同。3.白蛋白表达及肝细胞转化率:A组始终未见白蛋白表达。从B组到E组均提示白蛋白阳性表达,证明本实验能够诱导分化为肝细胞。在第7天及第14天时,B组、C组、D组、E组白蛋白表达逐渐增加,p均<0.05,差异均有统计学意义;第21天时,B组(69.45±2.27)、C组(77.81±0.90)、D组(87.68±2.10)、E组(98.71±0.71)逐渐增加,p均<0.05,差异均有统计学意义;肝细胞转化率在第21天时,B组(69.45±2.27)、C组(77.81±0.90)、D组(87.68±2.10)、E组(98.71±0.71)逐渐增加,p均<0.05,差异均有统计学意义;B组到E组从第7天到第21天随着IL-1β浓度的增加白蛋白表达增加,p均<0.05,差异均有统计学意义。4.甲胎蛋白表达:A组始终未见甲胎蛋白表达。在第7天、第14天及第21天,各个时间点B组、C组、D组、E组甲胎蛋白表达随着IL-1β浓度的增加逐渐增加,p均<0.05,差异均有统计学意义;从B组到E组,各组甲胎蛋白表达从第7天到第21天随着天数增加逐渐减少,p均<0.05,差异均有统计学意义;5.CK18表达:A组未见CK18表达。第7天、第14天、第21天时,各个时间点B组到E组CK18表达逐渐增加,p均<0.05,差异均有统计学意义;B组到E组,各组从第7天到第21天CK18表达率随着天数的增加而增加,p均<0.05,差异均有统计学意义。结论:肝细胞生长因子及肝细胞生长因子联合IL-1β都能诱导骨髓间充质干细胞有效的向肝细胞转化。并且IL-1β联合肝细胞生长因子的诱导效果强于单一肝细胞生长因子诱导效果。随着IL-1β浓度增加,诱导能力加强。