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目的胃癌是全世界范围内处于发病率第二位的恶性肿瘤,导致每年约有100百万人死亡。在中国,胃癌的发病率高居各种恶性肿瘤之首,每年新确诊患者达40万,大约死亡26万/年,占所有恶性肿瘤死亡的23.24%,同时仍然呈上升趋势。由于胃癌患者经常处于晚期才被确诊,因而预后较差,五年生存率低于20%。导致胃癌发生的因素很多,包括胃幽门螺杆菌感染,饮食,环境和遗传因素等,其中幽门螺杆菌是80%或更多胃癌患者的主要危险因素,已有研究提出其在胃十二指肠疾病中的作用。近来,尽管胃癌的诊断和治疗方面取得了一些进展,但是胃癌病人的预后仍然很差,尤其是晚期病人。尽管发现了一系列诸如p53,APC,C-met等胃癌相关的癌基因和抑癌基因,然而胃癌发生的分子机制依然不是十分清楚。目前microRNA与肿瘤发生发展的关系及潜在的诊断价值已成为肿瘤研究的新热点。微小RNA（miRNAs）是一种小分子非编码RNA,通过抑制基因mRNA的翻译或诱导mRNA的降解来调节大约30%人类基因的表达。近年来,大量的研究表明miRNA在细胞增殖、凋亡、发育、分化和代谢等过程中发挥了重要的作用。最近,miRNA的表达被证明与肿瘤的发生发展有密切的关系。如果一个miRNA在某种肿瘤中表达下调并且其靶基因是癌基因,那么这个miRNA就发挥抑癌基因的作用;同理,如果一个miRNA在某种肿瘤中表达上调并且其靶基因是抑癌基因或重要的控制分化基因,那么它就发挥癌基因的作用。因此,通过检测胃癌组织中表达失调的miRNA,并进一步确定其靶基因及其参与的信号调节通路,将对阐明胃癌发生的分子机制具有重要的理论意义。而且miRNA作为重要的生长调节和细胞周期调控分子,具有成为新一代肿瘤标记物的潜力,对于胃癌的早期诊断、分期和预后提示均具有重要的临床意义。本研究旨在通过RNA加尾引物延RT-PCR法实时定量检测miR-18b、miR-21、miR-148b、miR-365在胃癌中的表达水平。我们首先将总RNA加poly（A）尾后进行反转录,之后再用特异引物进行PCR扩增特异的miRNA,经凝胶电泳检测扩增产物的完整性和特异性后进行实时定量PCR,最后采用2-ΔΔCt法对检测结果进行分析。材料与方法实验用组织均取自于中国医科大学附属第一医院肿瘤外科2007年11月至2008年7月间的12例胃癌患者经外科手术切除的标本（取前均取得患者家属同意,并与之签订知情同意书）。所取癌组织及相对应正常组织均在标离体后30分钟内取得,并在液氮冷冻30分钟后放入-80℃冰箱保存。其中男性8例,女性4例,年龄（43-72）（平均56）岁,术前均未经放化疗。提取12例胃癌手术切除标本中癌组织及相应正常组织中的总RNA,在3′末端加尾并抽提后用5′端带40nt延伸序列的单碱基锚定Olig-dT引物进行反转录,得到约80nt的cDNA,然后用特异miRNA引物进行SYBR Green Real-time PCR扩增,并用2-ΔΔCt法对检测结果进行分析,计算其在癌组织与相应正常组织中表达水平的相对比值。实验结果一、相对定量2-ΔΔCt分析方法的优化用相对定量2—ΔΔCt法对SYBR Green Real-time PCR检测的结果进行分析。该实验要求对目的基因（miR-18b、miR-21、miR-148b及miR-365）和管家基因（U6SnRNA）分别做标准曲线,且其标准曲线的斜率之差M＜0.1.miR-18b、miR-21、miR-148b、miR-365和U6在260nm波长UV下定量化,并被10倍梯度稀释:105,104,103,102,101。结果显示miR-18b、miR-21、miR-148b、miR-365与U6标准曲线斜率之差M分别为0.062,0.003,0.004,0.093,均小于0.1,符合该分析方法的要求。二、miR-18b、miR-21、miR-148b及miR-365在胃癌中的表达为了证实4种miRNAs在胃癌中的表达水平,我们用SYBR Green Real-time PCR从12例胃癌患者手术切除标本的癌组织及相应正常组织中检测出成熟miRNAs和U6 sn RNA的表达水平。结果显示miR-18b、miR-21、miR-365分别在其中的6例、7例、8例标本的胃癌组织中呈高表达,而miR-148b在其中的7例标本的胃癌组织中呈低表达。结论RNA加尾和引物延伸RT-PCR法是一种可行的检测miRNAs表达的方法。miR-148b在胃癌组织中较在正组织中表达有下调趋势,miR-18b、miR-21、miR-365表达则有上调的趋势,提示mi R-148b与miR-18b、miR-21、miR-365可能是在胃癌发生发展过程中分别起抑癌基因和癌基因作用的重要分子。