小鼠LEAP-2在毕赤酵母中的表达及其活性鉴定

• 作 者: 王红亮
• 机 构: 河南师范大学
• 出 处: 河南师范大学
• 发表日期: 2006年期
• 关键词: 肝表达抗菌肽-2 巴斯德毕赤酵母 氯化锂 基因表达 抗菌活性 cDNA序列

目的克隆小鼠肝表达抗菌肽-2(Liver-expressedantimicrobialpeptide-2，LEAP-2)基因编码区的cDNA序列并进行序列测定，构建真核表达载体并在毕赤酵母GS115中表达，初步分析表达产物的活性。
方法从小鼠肝中提取总RNA，采用RT-PCR技术，获得mLEAP-2基因编码区的cDNA，扩增出mLEAP-2的前肽基因和成熟肽基因，重组入克隆载体pUCm-T，构建重组克隆载体pUCm-T-P和pUCm-T-M，转化进E.coliBL21，通过菌落PCR筛选，选择阳性克隆并测序。将二基因重组入真核表达载体pPIC9，构建重组表达载体pPIC9-P和pPIC9-M，通过菌落PCR筛选及限制性内切酶XhoI、EcoRI鉴定，筛选阳性重组子；将线性化后的重组质粒pPIC9-P和pPIC9-M氯化锂转化巴斯德毕赤酵母GS115，利用选择性培养基和PCR技术筛选获得阳性克隆；阳性菌落用甲醇诱导表达，前肽和成熟肽获得分泌表达，检测表达产物的抗菌活性。
结果将所得序列与GenBank提供的序列比较，基因序列完全相同；经甲醇诱导48h后，15％SDS-PAGE分析，表达出Mr14000和Mr11000的蛋白，通过初步活性分析，成熟肽具有一定的抑菌活性，其表达和活性受多种因素影响。
结论mLEAP-2基因的前肽和成熟肽在酵母中得到分泌表达；成熟肽具有一定的抑菌活性；成熟肽在pH6、甲醇量0.5％～1％、接种后30h再诱导时表达量最大，而成熟肽的抑菌活性与其含量有关，成熟肽具有一定的热和酸稳定性，碱稳定性略差。