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本文由相对独立的两个部分的研究成果组成,第一部分是对GABARAP调节Wnt信号通路进行研究,第二部分是对Varp作为Rab38的新的效应蛋白调节其功能进行研究。
正常的Wnt信号传导通路在胚胎发育过程中极其重要,而Wnt信号传导通路的异常活化则往往导致肿瘤发生。因此研究Wnt信号的传导机制具有重要意义。近年来,人们对Wnt介导的下游信号传导通路的研究取得了飞速的进展。目前已经建立起来的Wnt信号传导通路包括Wnt/β-catenin经典通路,Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路。Dishevelled(Dvl)是Wnt信号传导通路中的重要因子,在Wnt/β-catenin经典通路中,Wnt蛋白存在的条件下,Dishvelled蛋白被激活并抑制GSK3β对β-catenin的磷酸化作用,从而抑制细胞质内β-catenin的降解,使游离的β-catenin水平升高,调节下游基因的转录。Dishevelled是Wnt信号三条传导通路的交叉点,它在Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路的传导过程中都发挥着重要的作用。因此,寻找新的Dishevelled相互作用蛋白,通过研究这些蛋白的功能加深对Wnt信号通路的了解成为研究Wnt信号通路的重要手段。
本文的第一部分利用酵母双杂交方法筛选到了一个新的Dishevelled2的相互作用蛋白-GABARAP。研究的结果发现GABARAP与Dishevelled2之间存在相互作用,并且,GABARAP可以降低细胞质内游离β-catenin水平并抑制Wnt、Dishevelled2、β-catenin和β-catenin突变体响应的下游调控基因的转录。GABARAP在哺乳动物细胞中的定位因Dishevelled2的共同表达而发生变化,由在细胞质中的弥散分布转变为与Dishevelled2共定位,说明GABARAP可能在Dishevelled2行使功能的过程中有辅助作用而且可能通过与Dishvelled2之间的相互作用参与了对Wnt信号通路的调控。后续实验结果发现GABARAP可能影响了Dishvelled2的表达,同时还可以与β-catenin发生相互作用,并且影响后者在细胞核中的分布。同时,实验证据还表明,GABARAP抑制肿瘤细胞的增殖以及成瘤能力,并且影响Wnt信号通路下游基因的表达。这部分的结果说明GABARAP对Wnt信号传导通路有重要的调节功能。
Rab蛋白家族属于RasGTPase超家族,能够调节细胞的多方面功能,尤其在调节细胞内吞膜转运过程中起到非常重要的作用。在Rab参与调节的各阶段中,不同的Rab需要与其特定的效应蛋白(effectors)相互作用才能履行各种特定的功能。相关方向的研究对于深入了解Rab蛋白及其对细胞功能的调节有着重要意义。
Varp是本实验室通过酵母双杂交方法分离得到的一个新蛋白,目前对它的研究很少,只对其作为Rab21鸟苷酸转换因子的功能作了初步的研究。在本文第二部分的研究中,为了进一步探索Varp的生物学功能,利用酵母双杂交方法寻找其相互作用蛋白。Rab家族一个新的成员Rab38作为Varp的相互作用蛋白被筛选出来。Varp与Rab38的相互作用通过免疫共沉淀实验加以证明,并且确定Varp的ANK1结构域对于二者的相互作用是必需的。进一步的研究表明,Varp能够优先作用于活化形式(GTP结合形式)的Rab38,并且能够被后者募集到细胞内的囊泡状结构之上。说明Varp很可能作为Rab38的潜在效应蛋白,在Rab38参与调节的各种细胞功能中发挥作用。Varp是目前报道的Rab38的第一个效应蛋白。这一发现为Rab38和Varp的进一步功能研究提供了新的线索。