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1研究背景突触可塑性能否改善是治疗神经损伤疾病的重要指标,其包含结构可塑性和功能可塑性,前者是后者的形态学基础。而神经细胞突起的生长、延伸是结构可塑性的重要表现,也是突触可塑性在细胞水平的直观指标。生慧汤具有兼补心肾,上下互资的作用,临床上被用来治疗健忘。现代药理研究发现生慧汤能够改善记忆获得障碍小鼠的学习记忆能力。本课题组前期实验结果发现,四慧合剂(四逆散加生慧汤)能够明显提高疲劳大鼠的学习记忆能力,为了探索其分子机制将生慧汤拆成滋阴补肾组(山茱萸、熟地),宁心安神组(酸枣仁、柏子仁),补气健脾组(红参、茯神)及祛痰开窍组(远志、石菖蒲、白芥子)和四逆散一同作为实验药物检测其对细胞突起生长的作用。实验结果发现生慧汤拆方中补气健脾药组和祛痰开窍药组具有促进细胞突起生长的作用,且能促进与突触可塑性密切相关的GAP-43蛋白的转录水平提高。因此,本实验将从与学习记忆能力密切相关的突触可塑性着手,以PC12细胞为模型,细胞突起生长为主要检验指标,分别从细胞增殖和细胞分化的角度来探索药物是否具有营养细胞和促进细胞分化的能力,进一步找出具有促进学习记忆能力的中药有效成分,并初步探索其可能的发生机制。2研究方法第一部分,以PC12细胞为模型,采用、western blot方法检测生慧汤拆方中补气健脾药组(红参、茯神)和祛痰开窍药组(远志、石菖蒲、白芥子)对GAP-43蛋白表达水平的影响,进一步探索药组影响细胞突起生长的分子机制。第二部分,以PC12细胞为模型,选择远志及石菖蒲药对的水提物作为实验药物,在完全培养条件下,检测药物的安全有效浓度；在低血清培养条件下,分别从细胞增殖和细胞分化角度来观察药物对细胞的影响；其中,用CCK-8试剂盒检测细胞活力,观察药物是否具有神经营养作用；细胞形态学观察并统计梭形细胞率,细胞分化率及突起长度的方法来观察药物是否具有促进细胞分化的作用。第三部分,基于第二部分的实验结果,采用远志水提物为实验药物,通过RT-PCR法和western blot法来检测药物对PC12细胞GAP-43基因转录及蛋白表达水平的影响,探索药物促进神经突起生长的分子机制。第四部分,参考传统方剂中远志-石菖蒲配比,以细胞突起长度为检测指标,采用细胞形态学观察及统计分析为方法,初步探索在同一配伍比下不同浓度的志-石菖蒲药对对细胞突起长度的影响及同一浓度下不同配伍比的远志-石菖蒲药对对细胞突起长度的影响。3研究结果1生慧汤拆方中补气健脾药组和祛痰开窍药组的水煎剂显著促进了PC12细胞GAP-43蛋白的表达水平。2完全培养条件下,远志及石菖蒲的水提物均能明显提高细胞活力,无明显细胞毒性。3低血清培养条件下,远志石菖蒲药对中,远志水提物能够明显提高细胞分化水平；石菖蒲水提物能够显著抑制细胞分化,促进细胞增殖,具有一定的浓度依赖性。4远志水提物能够显著促进PC12细胞GAP-43基因转录及蛋白表达水平的提高。5远志-石菖蒲药对配伍比在1-4间对细胞突起生长有促进作用,以10mg/的低浓度作用于PC12时,配伍比例为1：1时促突起延伸效果最好,200mg/l的较高浓度作用于PC12细胞时,配伍比例为4：1时促突起延伸效果最好,配伍比1：1的药对有抑制细胞突起生长的效果。