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目的：蚯蚓纤溶酶(earthwormfibrinolyticenzyme，EFE)是一种从赤子爱胜蚓中提取出的活性蛋白。本课题组前期研究发现蚯蚓提取物具有抗肿瘤作用，其有效成分可能为EFE。在此基础上，本课题进一步多方位进行EFE抗消化系统肿瘤作用的临床前研究，包括蚯蚓纤溶酶的抑瘤作用、化疗增效作用、放射增敏作用等，并初步探讨其有无潜在抗肿瘤侵袭转移作用，为开发蚯蚓纤溶酶抗肿瘤作用的临床应用提供实验依据。
方法：1.抗肿瘤作用研究1.1EFE单用时抑瘤作用研究：(1)体外抑瘤作用：选用人肝癌细胞株Huh7、HLE、PLC/PCF/5、HepG2和SMMC-7721，经不同浓度、不同时间EFE作用后，用WST-1法检测EFE对肿瘤细胞的生长抑制作用。(2)体内抑瘤作用：根据体外实验结果，选用对EFE较为敏感的细胞株Huh7制成肝癌荷瘤裸鼠模型，设EFE高浓度组(1000uku/kg．d)、EFE低浓度组(500uku/kg．d)及对照组(生理盐水)，灌胃给药，1次/日，4周后处死小鼠，计算瘤重抑制率。1.2EFE与5-Fu联用时抑瘤作用研究：(1)体外实验：选用人肝癌细胞株SMMC-7721、人胃癌细胞株MGC-803、人食管癌细胞株ECA-109，分设5-Fu组、EFE组、5-Fu+EFE联合用药组及对照组(不加药)，根据IC50剂量加入药物，至预定时间后加入WST-1，然后测各组吸光度值并计算药物相互作用系数(CDI)。(2)体内实验；选用SMMC-7721细胞株制成肝癌荷瘤裸鼠模型，分设5-Fu组(腹腔注射给药)、EFE组(灌胃胃药)、5-Fu+EFE联合用药组及对照组(生理盐水灌胃)，4周后观察各组瘤重抑制率，计算CDI。1.3EFE与γ-射线联用时抑瘤作用研究：选用人食管癌细胞株ECA-109，经EFE作用24h后给予不同剂量γ-射线照射，再换用普通培养液继续培养14天，观察细胞克隆形成情况，根据细胞克隆形成率计算有无放射增敏作用；用流式细胞术检测细胞周期情况；RT-PCR法检测硒谷胱甘肽过氧化物酶(SeGPx)mRNA表达。2.抗肿瘤侵袭转移作用研究2.1EFE对肿瘤细胞粘附活性及侵袭、迁移能力的影响：选用SMMC-7721细胞，给予不同浓度EFE处理后，用体外粘附实验观察SMMC-7721与纤连蛋白(FN)以及与基质的粘附率、Boyden小室模型检测细胞的侵袭力及迁移运动能力。2.2EFE抗肿瘤侵袭转移作用的机理研究：(1)SMMC-7721细胞经EFE作用后，用RT-PCR、流式细胞术、Westernblot检测整合素β1、粘着斑激酶(FAK)在mRNA水平、蛋白质水平的表达情况。(2)检测EFE对SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤组织中整合素β1和FAK的mRNA及蛋白表达的影响。(3)Huh7、HLE细胞经EFE作用后，用Westernblot检测MMP-2蛋白表达情况。
结果：1.抗肿瘤作用研究结果1.1EFE单用时：(1)在体外，EFE对培养中的人肝癌细胞株Huh7、HLE、PLC/PCF/5、HepG2均有增殖抑制作用，作用72h时，半数抑制浓度(IC50)分别为2.11uku/ml、5.87uku/ml、25.29uku/ml和17.30uku/ml。(2)动物实验结果显示，EFE500uku/kg．d和1000uku/kg．d灌胃给药4周，对肝癌细胞Huh7裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为46.08％(P=0.026)、57.52％(P=13.002)。1.2EFE与5-Fu联用时：(1)体外实验中，EFE、5-Fu联合作用于SMMC-7721、ECA-109、MGC-803细胞24h、48h时，对细胞的增殖抑制作用较单独使用EFE或5-Fu均为明显，各组CDI均<1.0。(2)动物实验结果提示，EFE、5-Fu联合作用于SMMC-7721裸鼠移植瘤4周后，CDI为0.75。1.3EFE与γ-射线联用时：食管癌细胞株ECA-109经0.1、0.3uku/mlEFE作用24h后照射不同剂量γ-射线，2周后根据细胞克隆形成率计算出EFE的放射增敏比分别为1.37和1.59；同时，细胞周期检测提示ECA-109细胞经EFE作用后，G2期细胞的比例明显下降，SeGPxmRNA的表达明显下降。2.抗肿瘤侵袭转移作用研究结果2.1EFE对肿瘤细胞粘附活性及侵袭、迁移能力的影响：经不同浓度EFE作用后，肝癌细胞SMMC-7721与FN及基质的粘附性均有下降，细胞侵袭力及运动能力也有明显减弱。2.2EFE抗肿瘤侵袭转移作用的机理研究：经不同浓度EFE作用后，在体外培养和裸鼠移植瘤中，肝癌细胞SMMC-7721的整合素β1、FAK在mRNA及蛋白水平表达均有下降；肝癌细胞：Huh7、HLE的MMP-2蛋白表达显著下降。
结论：1.蚯蚓纤溶酶(EFE)对人肝癌细胞株Huh7、HLE、PLC/PCF/5和HepG2的生长有显著抑制作用。2.EFE可增强5-Fu在体内外对肝癌细胞SMMC-7721、食管癌细胞ECA-109、胃癌细胞MGC-803的生长抑制作用。3.EFE可增强γ-射线对食管癌细胞ECA-109在体外的生长抑制作用，增敏机制与EFE可清除ECA-109细胞经γ-射线照射后产生的G2期阻滞及下调ECA-109细胞抗氧化酶SeGPxtuRNA表达有关。4.EFE可降低肝癌细胞SMMC-7721的粘附、迁移和侵袭能力，降低SMMC-7721细胞整合素β1、FAK在mRNA及蛋白水平的表达；降低Huh7、HLE细胞MMP-2表达。
研究结果表明：EFE在体内外有抑瘤作用、化疗增效作用、放射增敏作用，并可以抑制肿瘤细胞粘附性及侵袭、迁移能力，其作用机理涉及多个环节。