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目的：研究针灸对实验性克罗恩病(Crohn's disease,CD)大鼠结肠组织、结肠成纤维细胞CTGF、Smad及细胞外基质的影响,从CTGF/Smad信号转导通路探讨针灸治疗克罗恩病及其肠纤维化的作用机制。
方法：
1.采用SD大鼠,参照国际公认的Morris方法制备大鼠CD模型。按随机表法将大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组、电针组和西药组。模型制备成功后,隔药灸组、电针组选取天枢、气海穴分别进行治疗,西药组以美沙拉嗪肠溶片灌胃液灌胃治疗。观察各组大鼠的体重变化,大鼠结肠大体形态损伤；采用HE染色、Masson染色检测CD大鼠病理组织学变化及胶原增生情况；免疫组化法观察各组大鼠结肠组织I型胶原、纤维结合蛋白(Fibronectin,FN)、Smad3、Smad7、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)的表达,并应用数字彩色图像分析技术进行图像分析；放射免疫法检测各组大鼠腹主动脉血清中Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)及透明质酸(HA)的浓度。
2.参照国际公认的Morris方法制备大鼠CD模型。按随机表法将大鼠分为正常组、模型组、隔药灸组、西药组。隔药灸组选取天枢、气海穴进行治疗,西药组以美沙拉嗪肠溶片灌胃液灌胃治疗。治疗结束后,采用消化法对大鼠结肠成纤维细胞(Colon fibroblast,CFB)进行分离培养；采用免疫组化法观察各组大鼠CFB的CTGF及FN的表达并进行图像分析；荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测各组大鼠CFB的Smad3mRNA及Smad7mRNA的表达。
结果：
1.模型组大鼠结肠黏膜有不同程度损伤,结肠大体形态损伤评分和组织学损伤评分明显高于正常组(P<0.01);经治疗后,隔药灸组、电针组,结肠肠壁结构得到不同程度改善,结肠大体形态损伤评分和组织学损伤评分明显低于模型组(P<0.05或P<0.01)。
2.与正常组相比,模型组大鼠结肠组织有大量的胶原纤维表达(p<0.01);经过隔药灸、电针治疗后,胶原纤维表达明显减少(p<0.01,p<0.05);与电针组相比,隔药灸组胶原纤维表达减少更为显著(p<0.05)。
3.与正常组大鼠相比,模型组CD大鼠血清中,Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)及透明质酸(HA)的浓度,均显著升高(P<0.01);经针灸治疗后,大鼠血清中PCⅢ、CⅣ及HA的浓度明显下降(P<0.01),隔药灸组大鼠血清PCⅢ、CⅣ浓度明显低于电针组(P<0.01)。
4.Ⅰ型胶原、FN、CTGF、Smad3和Smad7蛋白在正常结肠组织中微弱表达或不表达,而CD模型组大鼠结肠组织上述蛋白表达明显增多(P<0.05或P<0.01);经针灸治疗后,大鼠结肠组织Ⅰ型胶原、FN、CTGF、Smad3蛋白表达明显减少(P<0.01),Smad7明显增加(P<0.01),隔药灸组大鼠结肠CTGF蛋白表达明显低于电针组(P<0.01)。
5.大鼠肠成纤维细胞原代、传代培养成功；模型组CD大鼠CFB的CTGF、FN蛋白表达的表达明显高于正常组(P<0.01),隔药灸治疗后,其表达显著降低(P<0.01)。从检验结果看出,模型组CD大鼠CFB的Smad3mRNA表达有增加趋势,隔药灸治疗后,大鼠CFB的Smad3mRNA表达有降低趋势,模型组CD大鼠CFB的Smad7 mRNA表达有增加趋势,隔药灸治疗后,大鼠CFB的Smad7 mRNA表达有增加趋势,但均未统计学意义。
结论：
1.隔药灸、电针天枢和气海穴治疗对克罗恩病大鼠肠纤维化均有一定的改善作用,其中隔药灸的作用优于电针。
2.隔药灸、电针天枢和气海穴可以下调克罗恩病大鼠结肠异常增高的Ⅰ型胶原、FN的表达。
3.隔药灸、电针天枢和气海穴可以降低克罗恩病大鼠血清中Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)和透明质酸(HA)的浓度,其中,隔药灸对大鼠血清PCⅢ、CⅣ浓度的下调明显优于电针组。
4.隔药灸、电针天枢和气海穴可以降低克罗恩病大鼠结肠组织CTGF、Smad3蛋白的表达,增加Smad7蛋白的表达,其中,隔药灸对大鼠结肠CTGF蛋白表达的下调明显优于电针组。
5.隔药灸、电针天枢和气海穴能够下调结肠成纤维细胞CTGF、FN蛋白的表达。