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前言 抑郁症发病率逐年增加，对人类的健康和生命已构成威胁，并引起人们的广泛的关注。研究发现应激性生活事件是抑郁症的明显促发因素，且抑郁症患者大脑存在与慢性应激大鼠相似的整体形态的改变。而慢性应激动物模型所表现出来的行为特征的改变、血浆皮质激素的变化与抑郁症病人的表现极为相似，因此以应激制作抑郁症动物模型，其发病机理可能与人类抑郁症更接近。 既往关于应激所致抑郁的机制大多集中在应激后HPA轴的反应以及神经递质变化的研究和海马结构的损害。近来有研究表明前额叶(PFC)活力降低可以导致“假性抑郁”，特点是缺乏感情或兴趣、缺乏目标相关性行为，有多种任务执行缺陷。前额叶皮质在单相抑郁症(UD)或双相抑郁症症(BD)中均起作用。应激(Stress)是指机体受到各种应激原的刺激时，出现的以交感神经兴奋和下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)分泌增多为主的一系列神经内分泌反应，以及由此引起的各种功能和代谢的改变。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养素(Neurotrophins，NTs)家族的成员之一，BDNF通过靶源性、自分泌、旁分泌方式激发神经细胞上高亲和力信号传导通路而发挥其特殊的生物作用。 本研究参照文献，使大鼠连续三周处于应激状态，制作成应激模型，研究模型鼠前额叶神经元细胞变化，揭示慢性应激、前额叶神经元细胞活性变化和抑郁症之间的关系，探讨应激所致抑郁的机制，为临床预防和治疗抑郁性疾病提供理论参考依据和新的手段。 材料和方法 一、实验材料 1．实验动物 采用青年雄性Wistal大鼠巧只，体重210一2409。由中国医科大学实验动物中心提供。 2.主要试剂 兔抗大鼠BDNF多克隆抗体，生物素标记的山羊抗兔lgG，SABC(链霉素过氧化物复合物)免疫组化试剂盒，DAB显色剂，以上试剂均购于Boster公司。 3.主要实验仪器 YSD一4G型药理生理实验多用仪(安徽蚌埠医学院无线电二厂);MetaMo甲h/Cool Snap份A派70计算机图像分析系统。 二、实验方法 1.动物分组 大鼠适应环境一周后采用旷场分析法测定行为并称重。然后随机分为对照组5只和实验组10只。 2.应激过程 实验组10只大鼠，分笼喂养，每笼1只。实验第1一21天，接受各种不同的应激:电击足底、冰水游泳、摇晃、夹尾、热应激、禁食、禁水。每天给予l种刺激，每种刺激累计使用2一3次。 对照组5只大鼠，放人一笼中群养，实验第l一21天，不给任何刺激。 3.灌注取材与切片 实验第22天杀死所有大鼠，无论实验组还是对照组大鼠于第22天处死前再次测定行为并称重。每只大鼠用戊巴比妥钠行腹腔麻醉后，经左心室快速灌注37℃生理盐水Zoonil，继之灌注4℃的4%多聚甲醛溶液300nil，然后剥离脑，后固定48小时以上;梯度乙醇脱水，石蜡包埋后，行冠状切片。 4.免疫组化法检测BDNF蛋白 采用免疫组化ABC法检测切片中的BDNF蛋白。 5.图像分析 每只大鼠选取前额叶完好的切片1张，在计算机图像分析系统上分别测量双侧前额叶内BDNF阳性细胞的平均光度值。 6.统计学处理 采用SPSSn .5统计软件对数据进行分析。实验结果 1.体重和开场行为评定 实验前实验组与对照组在体重和开场行为指标上无差异。21天后，实验组与对照组相比，体重明显下降、中央格停留时间延长、水平穿越格数减少、直立次数减少、修饰次数减少、粪便粒数增多。 2.前额叶神经元细胞的光镜下表现 光镜下观察，正常对照组大鼠前额叶皮质中，BDNF阳性细胞表达较强，细胞排列密集，着色深，被染成棕黄色，免疫阳性颗粒主要分布于胞桨和细胞膜表面，有的有较长的突起。实验组大鼠前额叶皮质阳性细胞数量明显减少，且多数细胞呈空泡状，胞桨着色很浅。其中以右侧区明显。 3.前额叶神经元中BDNF的表达 通过比较实验组和对照组BDNF表达的平均光密度，可以看出，在左右即C区正常组大鼠BDNF的光密度均高于实验组。正常大鼠左右PFC区BDNF表达无差异。经过21天应激后，实验组左右PFC区的BDNF表达均低于正常对照组(P<0.01)，但右PFC区显著，同应激后左PFC具有显著差异。 讨论 到目前为止，动物抑郁模型制作方法一般有:药物诱发的抑郁动物模型、获得性无助模型、慢性应激模型、孤养模型、切除双侧嗅束模型。但这些模型单独用于研究尚有难以克服的假阳性和假阴性反应，因此有人主张同时联合应用其中的几种模型，可能会提高实验结果的可行性。另外，不同抑郁模型的制作方法其应激导致抑郁发作的病理生理机制各异。既往的一些研究大多采用单纯的物理应激方法来制作抑郁症模型，但物理应激不能很好的模拟抑郁症病人的心理社会应激，因此本实验综合了慢性应激(物理应激)和孤养(心理应激)两种经典模型，利用长期不可预见的中等强度的不良应激，造成分养动物的抑郁状态，这在抑郁症模型的制作方面是个有益的探索。 评价一个抑郁症模型的制作是否成功主要依据动物在行为上的变化，旷场行为分析是一种检测大鼠在新异环境中的探?