抗稻瘟病Pi2/9基因的群体遗传分析、克隆与鉴定

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植物抗性育种是植物抵抗病原菌最有效方法之一。深入探究水稻抗病基因遗传变异规律,对植物抗病基因合理、高效的利用以及抗病种质资源的正确保存具有十分重要的意义。植物抗病基因通常可以被分为5大类,其中NBS-LRR类型基因是植物抗病基因家族中最大的一类。本文重点研究NBS-LRR类型中一个重要的抗水稻稻瘟病多基因座位点,即Pi2/9位点。已有三个抗病基因从该位点克隆(Pi2,Pi9和Piz-t),但是我们对于Pi2/9位点同源基因的起源和进化历史还知之甚少。  为了揭示Pi2/9同源基因的进化方式,我们分别从水稻,高粱,短柄草和拟南芥中鉴定出156,5,1,和1个Pi2/9同源基因。利用分子遗传学的各种遗传参数,我们发现该位点基因存在“一快”、“一慢”两类截然不同的进化方式。其中,第一类基因(TypeⅠ genes)具有频繁的基因转换并受到极强的正选择作用,不同的拷贝之间具有很大的遗传差异,不同的基因型之间基因的拷贝数变化大,缺乏明确的基直系同源关系,各成员之间通过频繁的序列交换而形成大量的各种各样的嵌合体。然而,第二类基因(TypeⅡ genes)进化速率非常慢,在不同进化枝之间很少发生基因转换,核苷酸差异度和Ka/Ks都非常之小。有趣的是,从Pi2/9位点已经克隆的3个抗稻瘟病基因都属于第一类型的基因,说明这类基因通过不断的重组、转换等进化方式,在不同生态型中创造和保存最大差异的同源序列,是可以创造出具有特异性识别的R基因以应对快速变异的病原菌。  在水稻Pi2/9同源基因分类的理论基础上,我们选取第一类型基因作为候选基因,分别在21个栽培稻和1个野生稻中成功克隆了31个可能的抗病基因。同时在Pi2/9基因进化树上相邻的位点随机选取8个候选基因,并成功从5个高抗栽培稻中克隆20个可能的抗病基因。克隆得到的候选基因测序结果支持水稻Pi2/9位点基因是以一快一慢两种不同的方式进化。因时间和转基因水稻种子有限,我们第一期获得了22个转基因植株功能验证结果。结果表明,有7个转基因植株对一种或多种稻瘟病菌表现出明显的抗性,其成功率高达31.82%。其中有两个转基因植株分别对多达11个和8个稻瘟病病原小种表现出抗性,表明所克隆的基因中有对稻瘟病抗性很强的抗病基因。从而初步验证了我们的推测:大量克隆这些候选基因,就有可能分离到很多新的抗稻瘟病基因,从而实现抗病基因的大规模且快速克隆。
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