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背景： 肿瘤的转录组和基因组分析方法如微列阵芯片（microarray），RNA测序(RNA-Seq)和染色体免疫共沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing，ChIP-Seq)，被广泛用于识别肿瘤中失调的基因和信号通路。特别地，ChIP-Seq是发现新的转录因子结合位点和转录因子在不同肿瘤中调控的信号通路中不可或缺的方法。 最近，TCGA网站的数据为人们提供了关于多种肿瘤中有价值的高通量测序信息。这些数据使得研究者可以在成千上万病人样本中找到他们感兴趣基因的体细胞突变和拷贝数改变。 NRF2是正常细胞中的重要转录因子，它可以通过结合在位于它的下游基因启动子区域从而调控细胞内的氧化应激。这个启动子区域被称为抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)。经典的NRF2下游基因包括一相/二相药物代谢酶和细胞保护蛋白。NRF2受到KEAP1的负向调控进而被CUL3介导泛素化蛋白酶体降解。由于KEAP1-NRF2-CUL3轴的突变，导致NRF2信号通路的异常激活，从而在多种癌症中引发肿瘤和耐药。因此，NRF2是癌症中重要的药物靶点，而抑制NRF2的过量表达或许可以抑制肿瘤的发生和耐药。 在人非小细胞肺癌细胞A549中，我们分别建立了KEAP1过量表达和NRF2降表达的细胞株。为了在A549细胞中寻找新的NRF2下游基因，两个细胞株都进行了mRNA的芯片分析。利用TCGA网站上的RNA测序数据和其他生物信息学分析工具，本研究进行多组学分析方法去寻找两种人类肿瘤，肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)和头颈部鳞癌(Head and Neck Squamous Cell Cancer,HNSCC)中NRF2调控的基因、信号通路和潜在的生物标记物。另外，A549细胞中包含有KEAP1功能失活突变，从而引起NRF2的过量表达，本研究在该细胞中也进行了ChIP-Seq的分析。 目的： 利用高通量组学分析数据，寻找新的NRF2调控基因和信号通路以及肺腺癌或头颈部鳞癌等癌症中潜在的生物标记物。 方法： 1.细胞株构建 a.将pEGFP-C1和mKeap1-pEGFP的质粒分别转染到A549细胞中。 b.利用RT-PCR和WB方法分析NRF2及其下游基因HO-1、NQO1的mRNA和蛋白水平。 c.将两个细胞株中全部的RNA分别与昂飞公司的人类基因表达谱芯片杂交。 2.非小细胞肺癌的潜在标记物的鉴定 a.利用Agilent GeneSpring GX软件，分析KEAP1过表达的A549细胞芯片分析数据以及NRF2降表达的A549细胞芯片数据。其中KEAP1过表达的芯片数据来自本实验室的数据和公共数据，而NRF2降表达的芯片数据只来自本实验室。 b.利用DAVID网站和STRING数据库，对表达上调基因的进行功能注释和蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析。 c.利用RSAT工具分析已知或假定的NRF2下游基因启动子区的ARE序列。 d.对NRF2调控的代谢基因表达数据和TCGA网站中KEAP1蛋白表达失活的肺腺癌病人样本中的RNA表达谱数据进行相关性分析。 e.利用在线肿瘤生物标记物分析软件SurvExpress，对NRF2调控的代谢基因簇（NRF2regulated metabolic gene signature，NRMGS）进行总生存期分析和Kaplan Meier分析。 3.对头颈部鳞癌病人样本中NRF2下游基因表达水平的研究方法 a.利用TCGA网站中头颈部鳞癌病人研究中Version2-level3版本的RNA测序数据，找出其中的279个肿瘤组织样本与37个癌旁组织样本，并将279个肿瘤组织样本分成两组，包括54个KEAP1-NRF2-CUL3突变的肿瘤样本和225个野生型肿瘤样本。 b.将50个含有KEAP1-NRF2-CUL3突变的肿瘤样本分别与37个癌旁组织样本和225个其他肿瘤样本进行比较分析，并找出两组分析数据中共同含有的基因作为NRF2在头颈部鳞癌中的调控基因。 c.利用4组独立的头颈部癌症病人的预后数据对该基因簇进行病人预后分析。 d.分别利用DAVID和STRING数据库对这个基因簇进行功能注释和蛋白质-蛋白质相互作用分析。 4.A549细胞中NRF2结合位点的全基因组分析方法 a.将染色体免疫共沉淀进行测序分析 b.利用HOMER软件进行峰值定位和de novo基序识别分析 c.利用DAVID软件进行靶基因功能分析 d.利用定量PCR对ChIP-Seq数据进行验证 结果： 1.成功建立了pEGFP-CI和pEGFP-mKeap1分别过表达的细胞株。在Keap1过表达的细胞株（A549-mKeap1-5p）中，NRF2和其下游基因HO-1、NQO1的mRNA和蛋白水平明显低于对照细胞株。因此，成功构建了稳定表达Keap1的A549细胞模型。 2.在KEAP1过表达和NRF2降表达的两组A549细胞芯片数据中，发现了214个基因降表达倍数大于1.5倍的重叠基因，其中34个基因涉及小分子代谢过程。对这些基因进行启动子区域的研究发现，27个基因含有ARE可能受到NRF2的直接调控。在这27个基因中的12个基因，与KEAP1突变的肺腺癌RNA-Seq数据中野生型肿瘤样本相比，表达明显上调。因此，这12个基因被定义为NRMGS。7组独立的肺腺癌病人的预后数据都显示，这些基因是肺腺癌的预后标记物。 3.50个含有KEAP1-NRF2-CUL3突变的肿瘤样本与37个癌旁组织样本的比较分析结果显示，251个基因表达上调。50个肿瘤样本与225个其他肿瘤样本比较分析结果显示，25个基因表达上调。重叠分析的结果显示，17个基因在两组基因中均表达上调。同时，这些基因的表达上调与4组独立的头颈部癌症病人的预后数据中预后较差的病人数据呈现高度相关性。另外，GO，KEGG和PPI的分析显示，这些基因中的大多数都与药物代谢通路或者谷胱甘肽代谢通路相关。 4.CHIP-Seq的峰值分析鉴定了A549细胞中2395个Nrf2结合高度富集的位点，峰值覆盖的长度为150bp。KEGG信号通路分析的结果发现了肺癌中新的Nrf2调控的信号通路——黏着斑信号通路。ARE序列分析和荧光定量PCR的结果均证实了NRF2对黏着斑信号通路相关基因的调控。 结论： 综上所述，本课题发现了在肺腺癌中NRF2调控的代谢基因簇和头颈部鳞癌中KEAP1-NRF2-CUL3轴调控的基因簇。这些基因簇与肿瘤发生和耐药高度相关，并且可以作为多种NRF2信号通路激活的肿瘤中潜在的生物标记物和预后指标。另外，ChIP-Seq的结果揭示了一个新的NRF2调控的信号通路——黏着斑信号通路，它在肿瘤细胞的侵袭、迁移和代谢过程中发挥重要功能。