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研究背景脓毒症(Sepsis)是指机体对细菌、真菌、病毒等致病微生物感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍,其本质是细胞因子和炎症介质大量释放而导致失调的全身炎症反应综合征(SIRS),严重者可进展为脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)甚至死亡。近年来脓毒症成为国内外重症医学领域的研究热点,对其认识逐步加深,然而其发病率、死亡率仍居高不下,是重症监护病房患者死亡的首要病因。肺部既是脓毒症最常见的感染部位之一,又是脓毒症常见的早期受累部位,急性肺损伤(ALI)是脓毒症继发SIRS和MODS在肺部的表现,严重的进展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS),与脓毒症的高死亡率密切相关。ALI和ARDS具有相同性质的病理生理基础,ALI是ARDS的早期阶段,其特征在于广泛的炎症和危及生命的低氧血症,是肺内通气和血流灌注比例失调的结果,临床表现为顽固性低氧血症和呼吸窘迫,具有显著的死亡率。ALI/ARDS主要由于肺部的急性炎症和组织损伤,导致氧气和二氧化碳的气体交换减少,其病理变化可能有以下几种:释放炎性细胞因子,肺血管内皮损伤,表面活性物质的丧失(导致肺泡表面张力降低),肺水增加,肺间质纤维化。迄今为止,脓毒症致ALI/ARDS的确切机制仍未阐明,面临床上也缺乏理想的治疗手段。因此,深入探讨脓毒症,尤其是脓毒症早期继发MODS、ALI/ARDS的病理生理机制,寻求确切有效的干预措施,对脓毒症的救治和预后,具有十分重要的意义。消退素是源自二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的脂质介体家族,分别被称为E系列消退素(RvE)和D系列消退素(RvD)。大量研究表明消退素具有抗炎和促进炎症消退的作用。消退素D1(7S,8R,17S-trihydroxy-4Z,8E,10Z,12E,14E,19Z-docosahexaenoic acid,RvD1)为炎症过程中 Omega-3(ω-3)脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)产生的内源性抗炎促炎症消退介质,主要作用为抑制中性粒细胞浸润、调节炎症因子的平衡、预防肺组织纤维化、保护缺血再灌注后器官二次损伤等。研究显示杯状细胞分泌粘液是眼部过敏和早期干眼症主要病因,消退素D1可通过主动促进炎症消退而终止刺激分泌。另一项研究表明,消退素D1在过敏性气道反应中加速了气道粘液化生。我们的课题通过经典的盲肠结扎穿孔术(Cecal ligation and puncture,CLP)来建立脓毒症动物模型,研究消退素D1对CLP诱导的脓毒症小鼠肺损伤是否具有保护作用,通过观察不同干预因素组别小鼠肺组织病理学变化、肺水肿程度、炎症因子水平,并结合消退素D1受体-cAMP通路探讨其具体机制。我们还探讨消退素D1对小鼠肺泡巨噬细胞吞噬作用及表型转换和中性粒细胞凋亡调控作用,从而促进肺组织炎症消退的具体机制。最后我们进一步研究消退素D1对临床脓毒症患者和健康志愿者中性粒细胞的影响及具体机制,为脓毒症急性肺损伤的临床治疗提供新策略。第一部分消退素D1对CLP诱导的脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用目的研究消退素D1对CLP诱导的脓毒症小鼠的影响并探讨其可能机制方法将25-30g雄性C57BL/6小鼠随机分组:假手术(Sham)组;CLP模型组,即1%戊巴比妥钠(1mg/kg)腹腔注射麻醉后,行盲肠结扎穿孔术,同时予生理盐水补液(0.5ml/10g),保温毯复温;CLP+RvD1组,即建立CLP模型后,腹腔注入消退素D1(]00ng/mice);CLP+Alcohol组,即溶剂对照组(消退素D1溶于乙醇);消退素D1组,腹腔注射100ng消退素D1;CLP+RvD1+BOC-2组,即建立CLP模型后,腹腔注入消退素D1(100ng/mice)和消退素D1受体抑制剂BOC-2(600ng/kg);每组8只小鼠。术后24h取小鼠肺组织行HE染色,进行肺组织损伤评分观察肺组织损伤程度;取肺组织匀浆行Elisa检测炎症因子观察肺组织炎症细胞浸润情况,并检测肺组织cAMP浓度;收集腹腔灌洗液行巨噬细胞和中性粒细胞数量检测,计算巨噬细胞与中性粒细胞比值观察脓毒症损伤后小鼠免疫细胞变化;术后SPF级喂养小鼠8天,观察其存活率。结果1.CLP模型的建立:小鼠盲肠结扎建立CLP模型24h后取肺组织进行HE染色,明确小鼠CLP模型是否成功。结果显示,假手术组肺组织结构清晰,上皮细胞排列整齐,肺泡腔干净、匀称,而CLP组肺组织结构破坏明显、充血、水肿,炎性细胞浸润2.消退素对CLP诱导脓毒症小鼠的影响:假手术组肺组织结构清晰,上皮细胞排列整齐,肺泡腔干净、匀称,而CLP组和溶剂对照组(CLP+Alcohol)肺组织结构明显破坏、充血、水肿,炎性细胞浸润。消退素D1(100ng)治疗组(CLP+RvD1)可见肺组织结构明显改善,炎症细胞减少。相较于假手术组,消退素D1组(RvD1)肺组织无明显变化。依据肺组织病理学改变进行肺组织损伤评分显示:相较于假手术组,CLP组、溶剂对照组(CLP+Alcohol)以及消退素D1治疗组(CLP+RvD1)损伤评分显著增高(P<0.05);相较于CLP组,CLP+RvD1和RvD1组肺组织损伤评分显著降低(P<0.05)。肺组织湿干重比结果显示:相较于假手术组,CLP组、溶剂对照组(CLP+Alcohol)湿干重比增加(P<0.05),提示CLP损伤后肺组织水肿;相较于CLP组,CLP+RvD1和RvD1组肺组织湿干重比减少(P<0.05);相较于溶剂对照组(CLP+Alcohol),CLP+RvD1和RvD1组肺组织湿干重比减少(P<0.05),提示消退素D1减轻肺组织水肿。3.消退素D1抑制CLP诱导的炎症因子分泌:Elisa检测肺组织匀浆中炎症因子显示:相较于假手术组,CLP组、溶剂对照组(CLP+Alcohol)TNF-α、IL-1β、MPO表达量增多(P<0.05),提示CLP损伤后,炎症因子增多;相较于CLP组,CLP+RvD1和RvD1组肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、MPO表达量减少(P<0.05);相较于溶剂对照组(CLP+Alcohol),CLP+RvD1和RvD1组肺组织匀浆中TNF-α、1β、MPO表达量减少(P<0.05),提示消退素D1通过抑制炎症因子的产生减轻肺员伤。4.消退素D1对CLP诱导小鼠脓毒症中性粒细胞和巨噬细胞的影响:取小鼠腹腔灌洗液,流式结果显示,相较于假手术(Sham)组,CLP组巨噬细胞与中性粒细胞比值增加(Mcarphages/Neutrophils)(P<0.05),提示CLP损伤后,小鼠炎症细胞都增多;相较于CLP组,消退素D1(100ng)治疗组(CLP+RvD1)巨噬细胞与中性粒细胞比值增加(Mcarphages/Neutrophils)(P<0.05),提示消退素D1可通过调控巨噬细胞与中性粒细胞比率调控炎症反应。5.消退素D1调控CLP小鼠炎症反应依赖于其受体ALX:小鼠肺组织HE染色显示:CLP组肺组织结构明显破坏、充血、水肿,炎性细胞浸润。消退素D1(100ng)治疗组(CLP+RvD1)可见肺组织结构明显改善,炎症细胞减少。小鼠腹腔给予BOC-2(600ng/kg)后(CLP+RvD1+BOC-2),肺组织损伤状态未得到明显改善。依据肺组织病理改变进行肺组织损伤评分显示:相较于CLP组,CLP+RvD1组肺组织损伤评分显著降低(P<0.05);相较于CLP+RvD 1组,CLP+RvD 1+BOC-2组肺组织损伤评分增高(P<0.05)。肺组织湿干重比显示:相较于CLP组,消退素D1治疗组(CLP+RvD1)湿干重比减少(P<0.05),提示消退素D1减轻肺组织水肿;相较于CLP+RvD1组,CLP+RvD1+BOC-2组肺组织湿干重比增多(P<0.05),提示消退素D1减轻肺组织水肿从而减轻肺损伤的作用被BOC-2抑制。6.消退素D1受体依赖性抑制CLP诱导的炎症因子分泌:肺组织匀浆中炎症因子的变化显示:相较于CLP组,消退素D1治疗组(CLP+RvD1)TNF-α、IL-1β、MPO表达量减少(P<0.05),提示消退素D1通过抑制炎症因子的产生减轻肺损伤;相较于 CLP+RvD1 组,CLP+RvD1+BOC-2 组肺组织匀浆中 TNF-α、IL-1β、MPO表达量增多(P<0.05),提示消退素D1抑制炎症因子产生从而减轻肺损伤的作用被BOC-2抑制。7.消退素D1受体依赖性调控CLP小鼠中性粒细胞和巨噬细胞的变化:取小鼠腹腔灌洗液,流式细胞术检测巨噬细胞和中性粒细胞变化。我们发现,相较于CLP组,消退素D](100ng)治疗组(CLP+RvD1)巨噬细胞与中性粒细胞比值增加(Mcarphages/Neutrophils)(P<0.05),提示消退素D1可通过调控巨噬细胞与中性粒细胞比率调控炎症反应;相较于CLP+RvD1组,CLP+RvD1+BOC-2(600ng/kg)组小鼠肺组织巨噬细胞与中性粒细胞比值减少(P<0.05),提示消退素D1调控巨噬细胞与中性粒细胞比率从而减轻肺损伤的作用被BOC-2抑制。8.消退素D1受体依赖性促进CLP小鼠生存率:相较于假手术组(Sham),CLP组小鼠生存率显著下降(P<0.05);相较于CLP组,消退素D1治疗组(CLP+RvD1)小鼠生存率提高(P<0.05);相较于CLP+RvD1组,CLP+RvD1+BOC-2组小鼠生存率下调(P<0.05),提示消退素D1上调CLP小鼠8天生存率,而这一作用被消退素D1受体抑制剂BOC-2抑制。9.消退素D1受体对CLP损伤小鼠cAMP的影响:相较于CLP组,消退素D1治疗组(CLP+RvD1)小鼠cAMP浓度提高(P<0.05);相较于CLP+RvD1组,CLP+RvD1+BOC-2组小鼠cAMP浓度下降(P<0.05),提示消退素D1上调小鼠cAMP浓度,而这一作用被消退素D1受体抑制剂BOC-2抑制。结论1.本研究通过建立小鼠CLP模型可以成功复制脓毒症继发肺损伤的病理过程。2.消退素D1能够通过改善肺组织病理损伤,抑制肺组织炎症因子TNF-α、IL-1β、MPO分泌,以及上调巨噬细胞与中性粒细胞比值减轻炎症反应,保护肺功能,提高小鼠生存率。3.消退素D1调控小鼠CLP损伤脓毒症依赖于消退素D1受体ALX。第二部分消退素D1调控原代巨噬细胞和中性粒细胞促进炎症消退的机制目的研究消退素D1对小鼠原代巨噬细胞和中性粒细胞的影响并探讨消退素D1通过调控免疫细胞促进炎症消退的可能机制。方法分离小鼠骨髓中性粒细胞和肺泡巨噬细胞,不同剂量消退素D1(50,100,150 nM),脂多糖(lipolysaccharide,LPS 1ug/ml),BOC-2(消退素D1受体抑制剂,1OμM)或LY294002(PI3K抑制剂,1OμM)干预中性粒细胞,检测细胞凋亡率;干预巨噬细胞24h,将巨噬细胞与CMFDA Green标记的凋亡中性粒细胞以4:1比例共培养90 min,流式细胞术检测吞噬率;干预巨噬细胞24 h,CD06标记M2型巨噬细胞,流式细胞术检测消退素D1对M2表型的影响。结果1.消退素D1促进小鼠原代中性粒细胞凋亡:相较于空白对照组,LPS(1μg/ml)组和LPS+RvD1(100nM)组中性粒细胞凋亡增强(P<0.05);相较于LPS组,LPS+RvD1组中性粒细胞凋亡增强(P<0.05)。2.消退素D1剂量依赖性促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞:相较于空白对照组,消退素D1剂量依赖性促进巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞增强(P<0.05),且消退素D1 100 nM刺激的巨噬细胞吞噬率最强(P<0.05)。3.消退素D1受体和PI3K依赖性促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞:相较于正常对照组,LPS(1 μ g/ml)组巨噬细胞吞噬率下降(P<0.05);相较于LPS组,消退素D1(100nM)治疗组(LPS+RvD1)组巨噬细胞吞噬率增强(P<0.05);相较于LPS+RvD1 组,LPS+RvD1+BOC-2(10uM)组和 LPS+RvD1+LY(LY294002,10μM)组巨噬细胞吞噬作用降低(P<0.05)。4.消退素D1促进BALF刺激的巨噬细胞的吞噬作用:相较于正常对照组,BALF刺激组巨噬细胞吞噬率降低(P<0.05),消退素D1组细胞吞噬率增高(P<0.05);相较于BALF组,巨噬细胞消退素D1治疗(RvD1+BALF)组巨噬细胞吞噬率增强(P<0.05)。5.消退素D1受体和PI3K依赖性调控巨噬细胞吞噬:相较于空白对照组,LPS刺激组磷酸化磷脂酰肌醇激酶phospho-PI3K P85(P-P85)蛋白表达量减少(P<0.05),消退素D1组P-P85表达量增多(P<0.05);与LPS组相比,消退素D1+LPS组P-P85蛋白表达量上升(P<0.05);与RvD1+LPS组相比,BOC-2干预后P-P85表达量减低(P<0.05);各组中磷脂酰肌醇激酶PI3K P85(P85)蛋白表达量无显著差异(P>0.05)。6.消退素D1上调巨噬细胞M2表型的表达:与空白对照组相比,LPS组M2型细胞表达量降低,消退素D1组M2型细胞表达量增多;与LPS组相比,LPS+RvD1组M2型细胞表达量增多。结论1.消退素D1通过促进中性粒细胞凋亡抑制炎症反应,促进炎症消退。2.消退素D1促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞及M2型巨噬细胞表达,从而促进炎症消退。3.消退素D1促进巨噬细胞吞噬与P-P85相关。第三部分消退素D1对脓毒症患者中性粒细胞的影响及机制目的研究消退素D1对脓毒症患者中性粒细胞的影响并探讨其可能机制。方法抽取20例健康志愿者和40例脓毒症患者外周血,分离中性粒细胞。消退素D1预刺激中性粒细胞1 h后,检测中性粒细胞趋化、凋亡、内吞(Pagocytosis)、外吞(细胞外诱捕NETs)作用,活性氧(ROS)产生,细胞表面粘附分子的表达和COX-2、NF-κB蛋白表达。探讨并比较消退素D1对健康志愿者和脓毒症患者中性粒细胞的作用及可能机制。结果1.消退素D1抑制中性粒细胞趋化:志愿者组:相较于空白对照组,趋化因子IL-8和fMLP增强中性粒细胞趋化指数(Chemotactic Index)和迁移速率(Velocity)(P<0.05);相较于IL-8组,消退素D1干预组抑制IL-8诱导的中性粒细胞趋化指数(Chemotactic Index)和迁移速率(Velocity)(P<0.05);相较于 fMLP 组,消退素 D1干预组抑制fMLP诱导的中性粒细胞趋化指数(Chemotactic Index)和迁移速率(Velocity)(P<0.05)。脓毒症患者组:中性粒细胞功能异常,致使中性粒细胞在趋化因子IL-8和fMLP的作用下趋化反应不明显,细胞未发生明显迁移。2.消退素D1促进中性粒细胞的凋亡:相较于空白对照组,消退素D1(1OOnM)干预中性粒细胞4h和24h后,早期凋亡细胞(Dying)增多(P<0.05),提示消退素D1促进4h和24h健康志愿者和脓毒症患者中性粒细胞的凋亡。24h时,脓毒症患者早期凋亡细胞量少于志愿者,提示脓毒症患者24h中性粒细胞凋亡延迟,炎症反应持续存在。相较于消退素D1组,消退素D1组受体ALX 抑制剂BOC-2(1uM)干预4h后中性粒细胞凋亡减少(P<0.05);而PI3K抑制剂LY294002(1uM)干预4h后中性粒细胞凋亡率无明显变化(P>0.05),提示消退素D1促进中性粒细胞凋亡依赖于消退素D1的受体。3.消退素D1促进中性粒细胞NETs:脓毒症患者中性粒细胞NETs生成少于志愿者组,但无显著差异(P>0.05);PMA(25 nm)干预后,脓毒症患者PMA刺激组NETs生成明显多于志愿者PMA刺激组(P<0.05)。相较于空白对照组,PMA干预后细胞NETs生成增多(P<0.05),消退素D1干预后细胞NETs生成增多(P<0.05);相较于消退素D1组,消退素D1+PMA组NETs生成增多(P<0.05);提示消退素D1促进NETs生成。4.消退素D1促进中性粒细胞的吞噬功能:中性粒细胞吞噬E.coli和S.aureus的能力随时间延长而增强,60 min时达高峰。在15min和30min两个时间点,脓毒症患者中性粒细胞吞噬E.coli的能力低于志愿者组(P<0.05)。相较于志愿者组,在孵育30min和45min时消退素D1(100nM)组细胞吞噬E.coli增多(P<0.05)。相较于脓毒症组,在孵育30min、45min和60min时消退素D1组细胞吞噬E.coli增多(P<0.05),在孵育60min时消退素D1组细胞吞噬S.aureus增多(P<0.05),提示消退素D1促进中性粒细胞吞噬E.coli和S.aureus能力。5.消退素D1抑制中性粒细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成:相较于对照组,PMA刺激组和fMLP刺激组ROS生成减少(P<0.05);相较于消退素D1干预组,消退素D1+PMA组、消退素D1+fMLP组ROS产生增多(P<0.05);消退素D1干预组比空白对照组ROS产生增多(P<0.05);相较于PMA刺激组,消退素D1+PMA组ROS产生减少(P<0.05);PMA刺激脓毒症患者中性粒细胞后ROS生成较志愿者PMA刺激组增多(P<0.05),提示消退素D1抑制健康志愿者和脓毒症患者中性粒细胞ROS生成。6.消退素D1对健康志愿者和脓毒症患者中性粒细胞表面粘附分子的影响:志愿者各组中这些细胞表面粘附分子表达量无显著差异(P>0.05);脓毒症组,相较于未刺激组,消退素D1刺激组组CD14表达量降低(P<0.05),CD62L表达量增多(P<0.05),提示消退素D1抑制脓毒症患者中性粒细胞表面CD14表达,促进CD62L的表达。相较于志愿者组,脓毒症患者CD14、CD63表达量增高(P<0.05),CD62L表达量减少(P<0.05)。7.消退素D1调控中性粒细胞COX-2、NF-κB的表达:在健康志愿者和脓毒症患者中,消退素D1干预后中性粒细胞COX-2、NF-κB/P-P65蛋白表达量减低(P<0.05)。与健康志愿者相比,脓毒症患者中COX-2、NF-KB/P-P65、NF-KB/P65蛋白表达量增高(P<0.05)。结论1.消退素D1通过抑制中性粒细胞的趋化、促进细胞凋亡、增强细胞吞噬、抑制活性氧产生以及细胞表面标记分子,进而抑制炎症反应,促进炎症消退。2.消退素D1抑制中性粒细胞COX-2、NF-κB/P-P65的蛋白表达,提示消退素D1可通过调控NF-κB信号通路发挥炎症消退的作用。3.消退素D1对脓毒症患者作用强于健康志愿者,提示炎症损伤时消退素D1作用更强。