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本研究第一部分主要是构建基于HPV16E7CTL表位的穿膜肽融合疫苗，并进行免疫学功能研究。
在CPPHIVTat49-57的基础上，我们以HPV16E7蛋白的唯一HLA-A2/H-2kb+CTL表位E749-57为研究对象，在其N末端连接穿膜肽HIVTat49-57的氨基酸序列，合成了Tat49-57-E749-57融合肽疫苗。原CTL表位肽(E749-57)及其N末端自然延伸的多肽(NH2extended-E749-57)，以及HBcAg18-27作为对照肽，采用固相化学合成法分别合成各肽，再用HPLC法进行纯化和鉴定，其纯度均在95％以上。所得多肽抗原分别在C57BL/6小鼠(H-2Kb)的脾细胞和HLA-A2+健康人PBMC中进行了免疫学实验，分别就其体内外诱导T淋巴细胞增殖、分化；诱导抗体产生；诱导Th1型T细胞极化，诱导E749-57抗原特异性CTL产生及其介导的细胞毒作用等功能进行了检测。
结果发现，以N末端连接有Tat49-57的融合肽诱导T淋巴细胞增殖、分化的能力最强，诱导Th1型T细胞极化及抗原特异性CTL功能的活性最强。融合肽无论是在动物细胞还是人的细胞模型中，都诱导出了显著增强的E749-57特异性CTL活性，当效靶比为100∶1时，均在80％以上，与NH2extended-E749-57组、E749-57组和HBcAg组相比有显著性差异(P＜0.05)。而其对照肽，NH2extended-E749-57虽然在氨基酸数量上与CPP-CTL表位融合肽一致，均为18肽，但其诱导的特异性CTL活性与E749-57相比却没有显著性差异(P＞0.05)。为评价肽诱导CD8+T细胞产生细胞因子的能力，我们又用酶联免疫斑点检测(ELISPOT法)检测了其诱导脾细胞分泌活性IFNγ的能力。从我们的实验结果表明：较对照肽而言，经CPP修饰后的表位肽与脾细胞共孵育后，能诱导脾细胞分泌较高浓度的IFNγ，而能分泌IFNγ的活化的脾细胞斑点数也明显多于其他实验组别(P＜0.01)。NH2extended-E749-57组和E749-57组尽管也能检测出具有分泌活性的脾细胞，但显色斑点数两者没有显著性差异(P＞0.05)，无关对照肽HBcAg组有极少量显色斑点，考虑可能为非特异性染色现象。
本部分研究结果表明：在HPV16E7蛋白的唯一HLA-A2/H-2kb+CTL表位E749-57N末端连接上一CPPHIVTat49-57序列后，原CTL表位的免疫原性明显增强，为基于CTL表位设计治疗性肽疫苗研究，提供了新的分子设计思路和试验依据。
本研究的第二部分主要探讨HPV16E7-CPP融合性肽疫苗进入APC内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的可能机制。
为研究该融合肽疫苗是否在APC胞内能遵循MHC-Ⅰ类抗原提呈途径及具体的呈递途径，我们仍以Tat49-57-E749-57融合肽疫苗为研究对象，制备多克隆抗血清，通过免疫荧光染色和激光共聚焦显微技术，观察到了该融合肽的入胞效应；制备出抗E749-57/Kb复合物的单克隆抗体，并对其进行亲和力、特异性和敏感性的鉴定，利用该单抗结合免疫荧光技术和流式细胞仪检测技术分析了该Tat49-57-E749-57融合肽在APC胞内的抗原呈递动力学；为研究其呈递机制，分别用Bestatin，Lactacystin，BFA和NH4Cl就MHC-Ⅰ类抗原提呈途径的各个环节分别进行阻断；我们进一步通过间接免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜技术，分析了各抗原肽被MHC-Ⅰ类分子呈递的细胞内定位。
结果表明：该融合抗原肽在CPP的作用下，能快速进入活细胞的胞浆；此内在化过程不受环境温度的影响，而且表现为时间和浓度依赖。通过分析抗原呈递动力学变化，发现无论是在TAP正常还是缺失表达的细胞系中，Tat49-57-E749-57融合肽均能被MHC-Ⅰ类分子有效呈递，其在APC内的呈递强度甚至超过了表位肽E749-57，而不含CPP的对照肽NH2extended-E749-57则难以被MHC-Ⅰ类分子呈递。尤其是在TAP缺陷的细胞内，Tat49-57-E749-57被MHC-Ⅰ类分子呈递的高效性更加突出，并且，Tat49-57-E749-57在APC内的MHC-Ⅰ类限制性呈递的有效时间明显延长。通过对抗原呈递机制的研究，我们排除了经CPP修饰后的抗原肽与APC表面的MHC-Ⅰ类分子直接结合的可能性，证实Tat49-57-E749-57融合肽必需经过APC内部的加工处理，才能被MHC-Ⅰ类分子提呈，且该过程对布雷菲德菌素A(brefeldinA，BFA)敏感，但对蛋白酶体抑制剂和NH4C1抵抗；我们进一步通过间接免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜技术，分析了各抗原肽被MHC-Ⅰ类分子呈递的细胞内定位，发现Tat49-57-E749-57融合肽主要是在APC的ER腔内被MHC-Ⅰ类分子呈递；而对照肽E749-57和NH2extended-E749-57则在内吞系统中被低水平循环的MHC-Ⅰ类分子提呈。
本部分研究结果表明，CPP可能通过逆行囊泡转运机制促进与之融合的HPV16E7CTL表位肽有效进入APC的ER腔内，从而有效进入MHC-Ⅰ类抗原提呈途径，并显著延长外源性多肽抗原在APC内的MHC-Ⅰ类限制性呈递时间。这为抗HPV16感染治疗性融合肽疫苗的研制及免疫分子学机制提供试验依据，为HPV相关治疗性疫苗的设计提供了新思路。
本研究的第三部分主要探讨HPV16E7-CPP融合性肽疫苗在动物模型体内的抗瘤效应。
有研究表明，疫苗激发CTL反应的强度并不与其体内抗瘤效果完全一致，CTL反应虽然是抗瘤免疫的关键性因素，但并不能直接判定CPP-CTL融合肽作为肿瘤疫苗体内抗瘤效应的有效性。故有必要对我们制备的融合肽疫苗进行动物体内的免疫学效应检测。我们采用TC-1细胞株(HPV16E7+)完成本实验，首先建立了预防性肿瘤模型，即先用多肽免疫小鼠后，再接种一定数量的肿瘤细胞，设立不同的对照组，观察对各组小鼠的生存状况，以及实验结束时小鼠的存活率情况，并在其死亡或实验结束时，对其进行解剖，测量体内瘤体的体积，从而评价Tat-E749-57融合肽在小鼠体内的抑瘤效果。同时，为进一步评价Tat-E749-57融合肽疫苗是否能在荷瘤小鼠体内激发抗肿瘤效应，本研究又在治疗性肿瘤模型中对其进行检测，即先用TC-1肿瘤细胞株接种小鼠10d后，对各组小鼠进行疫苗免疫，第30d再加强免疫一次，测定其存活率及体内肿瘤体积大小。
从结果中可见，在预防性肿瘤模型中，PBS免疫对照组小鼠于肿瘤细胞接种后30d内，全部死亡，而E749-57免疫组在接种肿瘤细胞后40d，小鼠全部死亡，NH2extended-E749-57组在50d左右小鼠的存活率很低，相反地，Tat-E749-57预防性免疫组则在120d时仍有70％存活，其存活率明显高于对照组(P＜0.05)。在E749-57或NH2extended-E749-57免疫组中，小鼠体内的肿瘤体积均迅速形成并增大，在实验末期几乎100％小鼠均可以形成较大的瘤块，与PBS对照免疫组的肿瘤平均体积没有显著差异(P＞0.05)，但在Tat-E749-57免疫组的小鼠体内，肿瘤的生长受到明显抑制，在第120d，只有近30％的小鼠体内形成较明显的瘤块，体积较小，与另外3组相比差异显著(P＜0.05)。在治疗性肿瘤模型中，PBS免疫对照组小鼠于肿瘤细胞接种后30d内，全部死亡，而E749-57免疫组在接种肿瘤细胞后35d，小鼠全部死亡，NH2extended-E749-57组在45d左右小鼠的存活率很低，相反地，Tat-E749-57预防性免疫组则在120d时仍有50％存活，其存活率明显高于对照组(P＜0.01)。在E749-57或NH2extended-E749-57免疫组中，小鼠体内的肿瘤体积均迅速形成并增大，在实验末期几乎100％小鼠均可以形成较大的瘤块，与PBS对照免疫组的肿瘤平均体积没有显著差异(P＞0.05)，但在Tat-E749-57免疫组的小鼠体内，肿瘤的生长受到明显抑制，在第120d，只有近半数的小鼠体内形成较明显的瘤块，体积较小，与另外3组相比差异显著(P＜0.05)。
综上分析，我们在本研究中设计并合成的CPP-CTL融合肽疫苗，不仅在体外试验中能诱导出针对CTL表位的特异性免疫应答效应，而且在动物模型中有很好的肿瘤保护效应和治疗效果，证实了CPP-CTL融合肽疫苗激发抗瘤免疫的有效性，提示CPP-CTL是一种有效的抗HPV16感染及相关肿瘤的疫苗形式。